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专利号: 2022113336072
申请人: 嘉兴大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-11-04
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种拉曼免疫探针,其特征在于,所述拉曼免疫探针包括金纳米二聚体,以及修饰在所述金纳米二聚体上的信号标记分子和特异性结合目标检测物的抗体Ab1;

其中,所述金纳米二聚体由两个粒径不超过30nm的纳米金颗粒组装形成,间距不超过

1nm。

2.根据权利要求1所述的拉曼免疫探针,其中,所述金纳米二聚体由两个粒径20‑25nm的纳米金颗粒组装形成;

和/或,所述信号标记分子选自4‑硝基苯硫醇、4‑巯基吡啶、4‑巯基苯甲腈和4‑巯基苯甲酸中的任意一种;

和/或,所述拉曼免疫探针还包括封闭剂。

3.权利要求1或2所述的拉曼免疫探针的制备方法,其特征在于,所述方法包括:(1)金纳米二聚体的组装;

(2)信号标记分子和特异性结合目标检测物的抗体Ab1的修饰。

+

4.根据权利要求3所述的方法,其中,步骤(1)中,采用Ag焊接法进行金纳米二聚体的组装。

+

5.根据权利要求4所述的方法,其中,步骤(1)包括:将鱼精DNA、Ag溶液在缓冲体系中与胶体金溶液混合,进行诱导组装反应。

6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述缓冲体系包括TBE缓冲液。

7.根据权利要求6所述的方法,其中,所述缓冲体系包括TBE缓冲液,浓度为0.3 ‑1 。

8.根据权利要求5所述的方法,其中,所述鱼精DNA的用量使得其在反应体系中的终浓度为1‑5μg/μL;+ +

和/或,所述Ag溶液的用量使得Ag在反应体系中的终浓度为10‑20mM;

和/或,所述胶体金溶液的用量使得纳米金颗粒在反应体系中的终浓度不低于30 nM;

和/或,所述胶体金溶液中,粒径不超过30nm的纳米金颗粒占纳米金颗粒总量的90%以上;

和/或,所述诱导组装反应的方式包括:将混匀后的反应体系于20‑30℃下静置40‑

80min。

9.根据权利要求8所述的方法,其中,所述胶体金溶液的用量使得纳米金颗粒在反应体系中的终浓度为30‑50 nM;

和/或,所述胶体金溶液中,粒径20‑25nm的纳米金颗粒占纳米金颗粒总量的80%以上。

10.根据权利要求3‑9中任一项所述的方法,其中,步骤(1)中还包括对诱导组装反应的产物中的金纳米二聚体进行纯化的操作。

11.根据权利要求10所述的方法,其中,所述纯化包括采用凝胶电泳法筛选均一的金纳米二聚体,并对所述均一的金纳米二聚体进行回收。

12.根据权利要求3所述的方法,其中,步骤(2)包括先将信号标记分子与金纳米二聚体进行第一接触,获得金纳米二聚体‑信号标记分子,再将特异性结合目标检测物的抗体Ab1与金纳米二聚体‑信号标记分子进行第二接触,获得金纳米二聚体‑信号标记分子‑抗体Ab1结合物。

13.根据权利要求12所述的方法,其中,第一接触的反应体系中,信号标记分子的终浓度为5‑15μM;

和/或,第一接触的反应体系中,金纳米二聚体的终浓度为1‑5nM;

和/或,所述第一接触的条件包括:温度20‑30℃,时间1‑5h;

和/或,第二接触的反应体系中,特异性结合目标检测物的抗体Ab1的终浓度为1‑10μg/mL;

和/或,第二接触的反应体系中,金纳米二聚体‑信号标记分子的终浓度为1‑5 nM;

和/或,所述第二接触的条件包括:温度20‑30℃,时间1‑5h。

14.根据权利要求13所述的方法,其中,第一接触的反应体系中,信号标记分子与金纳米二聚体的终浓度比为3000:1‑5000:1;

和/或,在1000‑1500rpm的振荡条件下进行第一接触;

和/或,相对于1nM的金纳米二聚体‑信号标记分子,特异性结合目标检测物的抗体Ab1的用量为200‑2000 μg/mL;

和/或,在1000‑1500 rpm的振荡条件下进行第二接触。

15.根据权利要求12‑14中任一项所述的方法,其中,步骤(2)中,在将特异性结合目标检测物的抗体Ab1与金纳米二聚体‑信号标记分子进行第二接触之前,先采用EDC和NHS对金纳米二聚体‑信号标记分子进行免疫偶联活化,获得活化的金纳米二聚体‑信号标记分子,然后再将活化的金纳米二聚体‑信号标记分子与特异性结合目标检测物的抗体Ab1进行所述第二接触。

16.根据权利要求15所述的方法,其中,所述免疫偶联活化的反应体系中,EDC的终浓度为20‑30μM,NHS的终浓度为20‑30μM;

和/或,免疫偶联活化的反应体系中,金纳米二聚体‑信号标记分子的终浓度为0.5‑3 nM。

17.根据权利要求16所述的方法,其中,所述免疫偶联活化的反应体系中, EDC和NHS的终浓度比为1:0.8‑1:1.2;

和/或,免疫偶联活化的反应体系中,相对于1nM的金纳米二聚体‑信号标记分子,EDC的用量为20‑30μM。

18.根据权利要求3所述的方法,其中,所述方法还包括步骤(3)拉曼探针封闭。

19.根据权利要求18所述的方法,其中,步骤(3)包括将金纳米二聚体‑信号标记分子‑抗体Ab1结合物与封闭剂进行第三接触。

20.根据权利要求19所述的方法,其中,第三接触的反应体系中,封闭剂的终浓度为

0.5‑1.5重量%;

和/或,第三接触的反应体系中,金纳米二聚体‑信号标记分子‑抗体Ab1结合物的终浓度为0.5‑2 nM。

21.根据权利要求20所述的方法,其中,相对于1nM的金纳米二聚体‑信号标记分子‑抗体Ab1结合物,封闭剂的用量为0.5‑1.5重量%。

22.一种表面增强拉曼光谱‑胶体金免疫层析试纸,所述试纸包括依次排列在底板上的加样区、结合物区、观测区和吸水区,其中,所述结合物区包括结合垫,其特征在于,所述结合垫包含拉曼免疫探针,所述拉曼免疫探针为权利要求1或2所述的拉曼免疫探针或根据权利要求3‑21中任意一项所述的方法制备获得的拉曼免疫探针。

23.根据权利要求22所述的表面增强拉曼光谱‑胶体金免疫层析试纸,其中,所述结合垫采用硝酸纤维素膜制成;

和/或,所述加样区包括样品垫;

和/或,所述观测区包括层析膜,所述层析膜上固定有检测线和控制线,其中,检测线包被有特异性结合目标检测物的抗体Ab1,控制线包被有特异性结合抗体Ab1的抗体Ab2;

和/或,所述吸水区包括吸水纸。

24.根据权利要求23所述的表面增强拉曼光谱‑胶体金免疫层析试纸,其中,所述样品垫采用玻璃纤维膜和/或聚酯纤维膜制成;

和/或,所述层析膜采用硝酸纤维素膜制成;

2

和/或,所述吸水纸克重90‑150g/m,厚度0.35‑0.60mm,水爬速3‑5cm/s,蓄水量400‑600 2

g/m。

25.根据权利要求22‑24中任一项所述的表面增强拉曼光谱‑胶体金免疫层析试纸,其中,所述表面增强拉曼光谱‑胶体金免疫层析试纸还包括外壳,所述外壳在加样区位置设置有加样孔,在观测区位置设置有观测窗,观测窗的尺寸使得检测线和控制线能够通过该观测窗被完整地观测到。

26.权利要求1或2所述的拉曼免疫探针,或者根据权利要求3‑21中任意一项所述的方法制备获得的拉曼免疫探针,或者权利要求22‑25中任一项所述的表面增强拉曼光谱‑胶体金免疫层析试纸在样品中的病原体检测中的应用,其中,所述应用为非诊断性的应用。

27.权利要求1或2所述的拉曼免疫探针,或者根据权利要求3‑21中任意一项所述的方法制备获得的拉曼免疫探针,或者权利要求22‑25中任一项所述的表面增强拉曼光谱‑胶体金免疫层析试纸在样品中的猪流行性腹泻病毒检测中的应用,其中,所述应用为非诊断性的应用。