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专利号: 2022110839968
申请人: 淮阴工学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-15
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种采用关键酶SrfAD和YbdT在协同提高贝莱斯芽孢杆菌的基因工程菌的表面活性素产量和溶血能力中的应用;

所述基因工程菌以贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA为出发菌株,将编码SrfAD和YbdT关键酶的基因转化到贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA所得;所述贝莱斯芽孢杆菌突变株ΔRapF+SerA是以贝莱斯芽孢杆菌HCK2为出发菌株,敲除或者失活菌株基因组中负调控基因RapF和SerA所得;贝莱斯芽孢杆菌HCK2的保藏号为CCTCC NO:M2019396;编码关键酶SrfAD和YbdT的核苷酸序列分别如SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2所示。

2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述基因工程菌的构建方法包括如下步骤:

(1)以SrfAD和YbdT基因核苷酸序列设计引物,以枯草芽孢杆菌的基因组DNA作为模板,PCR扩增得到SrfAD和YbdT基因片段;

(2)采用限制性内切酶对SrfAD基因片段和质粒进行双酶切,得到酶切基因片段和线粒质粒片段,经酶连,得到重组质粒pTN‑PsrfT1T2‑SrfAD;

(3)采用限制性内切酶对YbdT基因片段和质粒进行双酶切,得到酶切基因片段和线粒质粒片段,经酶连,得到重组质粒和pTC‑PlacI‑IPTGT1T2‑YbdT;

(4)将重组质粒pTN‑PsrfT1T2‑SrfAD和pTC‑PlacI‑IPTGT1T2‑YbdT,转入贝莱斯芽孢杆菌突变菌株ΔRapF+SerA中,构建得到贝莱斯芽孢杆菌的基因工程菌ΔRapF+SerA+SrfAD+YbdT;

其中,步骤(1)所述的引物序列如下:

SrfADF :5′‑TTTGGATCCAAGGTGAGTGTGAGATGCTT‑3′

SrfADR :5′‑TTTCCATGGGATCTGAAAGAAGGCAGGAA‑3′

YbdTF: 5′‑TTTGCTAGCCGGCGAAGGTGTTTTATGAT‑3′

YbdTR: 5′‑TTTACTAGTTAAATCAAGCAGCACCGATG‑3′。

3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤(2)所述的限制性内切酶为Nhe I和Spe I,所述质粒为表达载体pTN‑PsrfT1T2;步骤(3)所述的限制性内切酶为BamH I和Nco I;所述质粒为表达载体pTC‑PlacI‑IPTGT1T2。

4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,步骤(2)所述重组质粒pTN‑PsrfT1T2‑SrfAD转入贝莱斯芽孢杆菌突变菌株ΔRapF+SerA中,构建得到突变菌株贝莱斯芽孢杆菌突变株  ΔRapF+SerA+SrfAD;再转入重组质粒pTC‑PlacI‑IPTGT1T2‑YbdT得到贝莱斯芽孢杆菌的基因工程菌ΔRapF+SerA+SrfAD+YbdT。

5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,生产表面活性素为基因工程菌进行发酵罐发酵:将菌种活化后制备种子液,按照体积比10‑15%接种量接入新鲜的发酵培养基,开始发酵,发酵过程中控制pH稳定在6.8到7.2,温度维持在35‑37℃,溶氧在25‑35%之间;当培养基中的葡萄糖消耗完之后,流加的葡萄糖溶液,维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0  .1‑

5g/ L;发酵周期40‑50h。

6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述发酵培养基组成为:葡萄糖10‑15g/L,谷氨酸5‑8g/L,K2HPO4 1‑3g/L,KH2PO4 1‑3g/L,KCl 1‑2g/L,MnSO4•7H2O 400‑500mg/L,FeSO4•7H2O 4‑5mg/L,CuSO4•5H2O 150‑160mg/L。