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专利号: 2022109496685
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-08-25
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种产丙酮酸的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP,其特征在于,所述解脂耶氏酵母工程菌WSMHP是将解脂耶氏酵母YW100‑1基因组中草酰乙酸转运蛋白编码基因Oac1p敲除,同时过表达丙酮酸羧化酶编码基因Pyc2和磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶编码基因Pck1获得的;所述草酰乙酸转运蛋白编码基因Oac1p核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;所述丙酮酸羧化酶编码基因Pyc2核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示,磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶编码基因Pck1核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.如权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP,其特征在于,所述解脂耶氏酵母工程菌WSMHP按如下步骤构建:

(1)将质粒pCRISPRyl的原有营养缺陷型标记基因Leu替换成潮霉素抗性基因HPH,得到CRISPR‑HPH质粒;

(2)根据靶标基因Oac1p设计gRNA序列,将20 bp的gRNA序列当作引物的同源臂,以tRNA

CRISPR‑HPH为模板进行全质粒扩增,将gRNA序列插入到SCR1 启动子表达位点,得到CRISPR‑HPH‑Oac1p gRNA质粒;所述gRNA序列如SEQ ID NO.8所示;

(3)以解脂耶氏酵母YW100‑1基因组为模板,分别扩增Oac1p基因上游1kb碱基序列,启动子pEXP1片段和Oac1p基因下游1 kb碱基序列;以酿酒酵母BY4741基因组作为模板,扩增来源于酿酒酵母BY4741的Pyc2和Pck1基因;以质粒JMP113作为模板扩增启动子Loxp‑URA3‑' ' ,loxp‑pTEF片段;通过重叠延伸PCR获得5 oac1p‑Loxp‑URA3‑loxp‑pTEF‑5Pyc2和3 Pyc2‑,pEXP1‑Pck1‑3Oac1p两个大片段,同Pyc2基因以及CRISPR‑HPH‑Oac1p gRNA质粒一起电转导入解脂耶氏酵母中,得到同源重组后的解脂耶氏酵母工程菌WSMHP。

3.一种权利要求1所述解脂耶氏酵母工程菌WSMHP在发酵甘油制备丙酮酸中的应用。

4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述发酵采用摇瓶发酵的方法,具体为:将解脂耶氏酵母工程菌WSMHP接种于YPD液体培养基中,于30℃,200rpm培养24h,将培养液以初始菌体浓度OD600 = 0.5接种于含50 g/L甘油的YNG培养基中,于30℃,200rpm发酵培养至OD600为4.0‑5.0时,获得含丙酮酸的发酵液,分离纯化,获得丙酮酸;YPD液体培养基质量组成:10 g/L酵母提取物,20 g/L葡萄糖,20 g/L蛋白胨,溶剂为去离子水,pH值自然;YNG培养基质量组成:6.7g/L YNB,溶剂为去离子水,用Na2HPO4‑柠檬酸缓冲液调节pH到4.0。

5.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述发酵采用发酵罐发酵的方法,具体为:将解脂耶氏酵母工程菌WSMHP接种至含60g/L甘油的发酵培养基中,在30‑32 ℃、pH值4‑4.5、溶氧量40‑50%条件下进行发酵罐发酵,获得含丙酮酸的发酵液,分离纯化,获得丙酮酸;所述发酵培养基组成为:10 g/L (NH4)2SO4、1.4 g/L MgSO4·7 H2O、2 g/L KH2PO4、0.8 g/L CaCl2、0.5 g/L NaCl、1 μg/L维生素B1,溶剂为去离子水,pH值自然。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,发酵罐发酵时,甘油采用分批方式加入,首次加入60 g/L,当甘油浓度低于20g/L时,分批补加甘油,每次补加40 g/L。

7.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述发酵罐发酵前,解脂耶氏酵母工程菌WSMHP先进行活化培养和种子扩大培养,再将种子液以体积浓度10%的接种量接种至发酵培养基,所述活化培养和种子扩大培养为:解脂耶氏酵母工程菌WSMHP接种至YPD液体培养基中,30℃过夜培养,培养液以体积浓度6‑7%的接种量转接至含2 g/L甘油的种子培养基,

30℃摇瓶培养18 h,获得种子液;所述种子培养基:0.4 g/L胰蛋白胨、酵母提取物0.2 g/L、

0.24 g/L KH2PO4、1.7 g/L K2HPO4·3 H2O,溶剂为蒸馏水,pH值自然;YPD液体培养基质量组成:10 g/L酵母提取物,2 g/L葡萄糖,2 g/L蛋白胨,溶剂为去离子水,pH值自然。