1.用于酶放大可视化检测新冠抗原的磁性‑贵金属复合纳米酶,其特征在于它是以树枝状介孔二氧化硅dSiO2为载体,该载体上修饰接枝聚乙烯亚胺PEI作为中间介质层,利用dSiO2载体上PEI的氨基的配位作用依次负载磁性纳米颗粒Fe3O4和纳米颗粒Pt,最后经羧基化修饰得到的树状介孔dSiO2/Fe3O4/Pt‑PEI复合结构。
2.如权利要求1所述的用于酶放大可视化检测新冠抗原的磁性‑贵金属复合纳米酶,其特征在于所述树枝状介孔二氧化硅dSiO2的制备方法为:以十六烷基三甲基溴化铵CTAB为模板,水杨酸钠为结构导向剂,三乙醇胺作为催化剂,以水为溶剂,于70‑90℃下搅拌反应
0.5~2h后,加入硅源硅酸四乙酯,继续搅拌反应2~5h,即制得所述超大孔径的树枝状介孔二氧化硅模板;其中,所述十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸钠和三乙醇胺的质量比为1:0.4~0.6:0.1~0.3,优选为1:0.55~0.6:0.16~0.2;所述十六烷基三甲基溴化铵质量与硅酸四乙酯体积之比为(0.08~0.1)g:1mL。
3.如权利要求1所述的用于酶放大可视化检测新冠抗原的磁性‑贵金属复合纳米酶,其特征在于该磁性‑贵金属复合纳米酶的具体制备方法为,包括以下步骤:
1)磁性四氧化三铁负载的树枝状介孔二氧化硅dSi/IO‑PEI复合微球的制备将树枝状介孔二氧化硅dSiO2分散至无水乙醇中,加入铁盐和聚乙烯亚胺PEI,再加入三甘醇超声均匀;在氩气气氛下,于200~220℃猛烈搅拌反应1.5~2.5h,再持续加热到280~
290℃,搅拌反应0.5~1.5h,冷却到室温后磁分离得到产物,用乙醇洗涤数次,获得磁性四氧化三铁负载的树枝状介孔二氧化硅复合微球,将其标记为dSi/IO‑PEI;
2)树枝状介孔二氧化硅微球/四氧化三铁/铂纳米微球dSi/IO/Pt‑PEI的制备将步骤1)获得的dSi/IO‑PEI微球加入至超纯水中,混合均匀后,加入铂盐和聚乙烯吡咯烷酮PVP超声均匀后在冰水浴下搅拌5~20min,使铂盐负载于dSi/IO‑PEI微球上;然后加入硼氢化钠溶液搅拌反应1~3h,使dSi/IO‑PEI微球上负载的铂盐还原成铂纳米颗粒,反应完成后磁分离得到产物,将产物用超纯水洗涤数次,即得到树枝状介孔二氧化硅微球/四氧化三铁/铂纳米微球,将其标记为dSi/IO/Pt‑PEI;
3)羧基化dSi/IO/Pt‑PEI微球的制备
将步骤2)所得dSi/IO/Pt‑PEI微球分散于无水DMF中,然后加入丁二酸酐后在室温下搅拌反应16~20h,在反应完成后通过磁分离获得产物,将产物用超纯水洗涤数次,即得到经羧基化修饰得到的树状介孔dSiO2/Fe3O4/Pt‑PEI复合微球,将其标记为dSi/IO/Pt‑PEI‑COOH。
4.如权利要求3所述的用于酶放大可视化检测新冠抗原的磁性‑贵金属复合纳米酶,其特征在于步骤1)中,树枝状介孔二氧化硅dSiO2、铁盐和聚乙烯亚胺PEI的投料质量比为60~70:350~380:35~45,铁盐为三乙酰丙酮铁。
5.如权利要求3所述的用于酶放大可视化检测新冠抗原的磁性‑贵金属复合纳米酶,其特征在于步骤1)中dSiO2与步骤2)中铂盐和聚乙烯吡咯烷酮PVP的投料质量比为60~70:20~22:45~55,铂盐为四氯铂酸钾;铂盐与硼氢化钠的投料质量比为1.4~1.5:1。
6.如权利要求3所述的用于酶放大可视化检测新冠抗原的磁性‑贵金属复合纳米酶,其特征在于步骤1)中dSiO2与步骤3)中丁二酸酐的投料质量比为40~42:50。
7.一种用于新冠S蛋白抗原免疫层析快速检测分析的试纸条,使用了权利要求1‑6任一项权利要求所述的用于酶放大可视化检测新冠抗原的磁性‑贵金属复合纳米酶,试纸条包括如下组装步骤:
1)dSi/IO/Pt‑PEI‑COOH信号探针的制备:将所述磁性‑贵金属复合纳米酶分散于PB缓冲液中,加入EDC和Sulfo‑NHS并搅拌反应20‑40min,以活化缓冲液中的磁性‑贵金属复合纳米酶表面羧基;将活化的磁性‑贵金属复合纳米酶离心弃去上清并分散于PB缓冲液中,然后加入新冠S蛋白单克隆检测抗体,于室温下反应2~3h,再加入终浓度为0.5~2%的BSA封闭
1~3h;反应结束后,将产物用PB缓冲液洗涤数次,即得dSi/IO/Pt‑PEI‑COOH信号探针,将其以3~5mg/mL的浓度配制于含0.05~0.2%BSA的PBS缓冲液中得到信号探针溶液;
2)试纸条的制备,包括以下过程:
S1:样品垫和结合垫在使用前均使用含有0.5%~2%BSA的处理液浸泡处理,充分浸润后取出干燥即预处理完成;
S2:在结合垫上喷涂信号探针溶液后,烘干处理;
S3:NC膜的T线上包被新冠S蛋白单克隆捕获抗体,NC膜的C线上包被羊抗鼠抗体IgG,烘干处理;
S4:将结合垫搭接于NC膜靠近T线的一端,吸收垫搭接于NC膜靠近C线的一端,样品垫再搭接于结合垫的远离NC膜的一端,切割形成免疫层析试纸条。
8.如权利要求7所述的试纸条在新冠S蛋白抗原免疫层析快速检测分析中的应用,其特征在于应用方法包括以下步骤:
1)标准曲线的绘制:将一系列不同浓度的含新冠S蛋白抗原的溶液,分别滴加到免疫层析试纸条的样品垫上,溶液在毛细作用下逐渐向免疫层析试纸条的NC膜上层析,15‑30min后,将含有3,3',5,5'‑四甲基联苯胺TMB和过氧化氢H2O2的显色液滴加在NC膜上,1~3min后通过信号探针与TMB的催化反应达到信号放大的效果,之后通过裸眼快速定性判断是否存在新冠S蛋白抗原,并拍摄NC膜上T线的照片,T线区上显示蓝色信号,用颜色识别软件读取T线灰度值获得T线区的蓝色信号强度灰度值,以该蓝色信号灰度值为纵坐标、新冠S蛋白抗原的浓度为横坐标绘制标准曲线,计算线性回归方程;
2)实际样品的检测:将含有样品的溶液滴加到免疫层析试纸条的样品垫上,溶液在毛细作用下逐渐向免疫层析试纸的NC膜上层析,15‑30min后,将含有3,3',5,5'‑四甲基联苯胺TMB和过氧化氢H2O2的显色液滴加在NC膜上,1~3min后通过信号探针与TMB的催化反应达到信号放大的效果,之后通过裸眼快速定性判断是否存在新冠S蛋白抗原,拍摄NC膜上T线的照片,T线区上显示蓝色信号,用颜色识别软件读取T线灰度值获得T线区的蓝色信号强度灰度值,代入步骤1)所得线性回归方程,即可推断出样品中的新冠S蛋白抗原含量。