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专利号: 2022104415215
申请人: 浙江工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-07-29
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体,其特征在于,所述甲酸脱氢酶突变体是将SEQ ID No .2所示氨基酸序列突变为下列之一:(1)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第246位谷氨酸突变为甘氨酸、第272位精氨酸突变为亮氨酸、第379位组氨酸突变为丝氨酸;(2)第198位丙氨酸突变为甘氨酸;(3)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺;

(4)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第272位精氨酸突变为亮氨酸;(5)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第246位谷氨酸突变为甘氨酸;(6)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第272位精氨酸突变为亮氨酸、第246位谷氨酸突变为甘氨酸;(7)第198位丙氨酸突变为甘氨酸、第221位天冬氨酸突变为谷氨酰胺、第272位精氨酸突变为亮氨酸、第246位谷氨酸突变为甘氨酸、第379位组氨酸突变为赖氨酸。

2.一种含权利要求1所述甲酸脱氢酶突变体编码基因的重组基因工程菌。

3.一种权利要求1所述NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体在构建氧化还原酶辅酶再生体系中的应用。

4.一种权利要求1所述NADP依赖型甲酸脱氢酶突变体构建的氧化还原酶辅酶再生体系在制备L‑草铵膦中的应用。

5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的应用以2‑氧代‑4‑[(羟基)(甲基)膦基]丁酸为底物,以草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶突变体共表达重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂,加入甲酸铵和NADP,以pH5‑9的缓冲液为反应介质构成辅酶再生体系,在20‑50℃、400‑600rpm下反应,反应液分离纯化,获得L‑草铵膦;所述草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶突变体共表达重组工程菌是将草铵膦脱氢酶编码基因与甲酸脱氢酶突变体编码基因共同转入宿主菌构建而成,其中草铵膦脱氢酶编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述辅酶再生体系中,生物催化剂加入量为

2‑10gDCW/L;甲酸铵加入终浓度为100‑1500mM;NADP加入终浓度0.1‑0.5mM;底物2‑氧代‑4‑[(羟基)(甲基)膦基]丁酸加入终浓度为100‑1500mM。

7.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述草铵膦脱氢酶和甲酸脱氢酶突变体共表达重组工程菌是采用一步克隆法将甲酸脱氢酶突变体基因克隆到含草铵膦脱氢酶基因的pETDuet‑1‑PPTGDH载体的Nde I和Avr II酶切位点之间,转入宿主E.coli BL21(DE3),构建共表达重组工程菌。

8.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述生物催化剂按如下方法制备:将甲酸脱氢酶突变体和草铵膦脱氢酶共表达重组工程菌接种至含50μg/ml氨苄霉素抗性的LB液体培养基,37 ℃,200rpm下培养12h,再以体积浓度2%接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中,于37 ℃,180rpm下培养至菌体OD600达0.6‑0.8,加入终浓度为12μg/mL的IPTG,18 ℃下诱导培养16h后,4 ℃、8000rpm离心15min,弃去上清液,收集沉淀,用pH 7.5、20mM磷酸钠缓冲液洗涤两次,获得湿菌体。

9.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述反应液分离纯化的方法为下列一种:(1)将反应液直接进行喷雾干燥,获得L‑草铵膦粉剂;喷雾干燥的条件为进口温度为200 ℃,出口温度为100 ℃,流速5 mL/min;(2)将反应液加入甲醇中,搅拌均匀,通入氨气,10℃搅拌

10 h,过滤,滤饼90 ℃真空干燥2 h,得L‑草铵膦铵盐粉剂;所述甲醇用量以反应液体积计为128‑640g/L;所述氨气通入量以反应液体积计为1.5‑6mol/L。