利索能及
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专利号: 2022101866561
申请人: 南京师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-08-18
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种裂殖壶菌基因工程菌株,其特征在于,它以裂殖壶菌为出发菌株,敲除奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶基因和多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶基因。

2.根据权利要求1所述的一种裂殖壶菌基因工程菌株,其特征在于,所述奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶基因LE1的序列为:

ATGGGGGCGATTACAGCCTTCGCAGCGGCGACGGCCATCGCGGCAGCGGGACTCGCGAGCGAAGCGAGGGCGCAGGATACTGTGCGCGGACTCGAGGAGATAGACTTTCGCATCGCGCAAGAGGCATGGACGCAGATCGAAAACGCGACCTACGATGACGAGCTCGCCGTGATGTATGAGAATGACAGAGTTCAGGTGACAAGAACGGCTGACACGATTTTCGAGCTCGGAAACTCGCTGTGCTGGATCGTTTCCGAGGAGACCAACGATGCCGAGGACTGGATCGACAATCTCGATTTCGGACAAACGAAGATCTTGTCCGTGGAAGAAGGCGAGAACGAGAGTGGCTCGCCTTCCGAGGAGTGCGGATGCGCTTTTTCCTTGTTCGGGTGGTGCCTCAAGTACAACACCTGCGACGACGAGTCGAATGGCAGCTACAAAACACTTGGCAAGGGATATTCCGGCTTTGTCAACGCCTACAATGGTCTGCGCCATGATGTGTGGGAGCGCGTAAAGGACGTCTGCGACATGGAAAACGATGTGCTCATGATCGCCGGCTACTCTCGCGGTGGCGCCCTCGCCAACCTCTTTGGTTTTGCAGTCTATTCAGAAGGCCTTTGGGACCCCGAGCGAATGGCTTCAATCACCTTTGGATCCCCACGCGTCCTTGTCAACAATGATAGCGACAACGTGCACAGTCAGTACTACCAGCTTCGCCTCGTGTACCGTGACGACCCAGTTCCTGCCTTTCCCATGAACAACTTTGGTTTTGAGCACTTTGGCGAGATGCACTGCTTCGAGTGCCAGTACCAGGAATCGCGTGACGCCCCTTCAAGTCTTCAGTTATTGTATGGTACCGATGTCGATGACCACACCAGCTACAATGAATGGTTCGACTAA。

3.权利要求1或2所述的一种裂殖壶菌基因工程菌株,其特征在在于,所述多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶基因LE2的序列为:

ATGAGCCTTTGCTCTTGCTACTATGTTTTCTGCTGCTTTATGTGCTGCAGCTACGCTCGCTGTGCGAGCAGAACCTCCATTCGCGGTGTCCTCCGTCTTGGCATGGCGTGGAAATTTCTCGTTGGCCTCCTCATCTACACCATCTTCTTTGCCCTGCTCGAGGAGGTCTTCAACTTCAACTGTAGCCTTGTGCCGTTTGTCGGCATGTTGAGCGTTCTTCGCGTCTGCACTACTTCCGATGAGAACGGCGATCTCTACTGCTCGATGGATGTGTATCCTACCGCCTTTCGTCGCGCAATCGGCGTTACCGTCCTCTTTGTCCTCGAAATCTCAATCTTTTGGTACATTGGTCGCACCTCGAAAAGGGTTCATCAGCGAATTGCGGCAATTCCGTATGCCCTCAATCGGTACAATTACCTCAGTGTGACCTTTACTCAAGCTACTATTTCGCTTTTCTGGACACTTATTTTTCTCCTTGGTGTACTGGAAACATGCGTTCCAAGTGTTTCTGTCAACATTCAACGTCCGATGGTGAATATCACCGCGGATGGATTGCTCGATAGCGTGTATCTCGAGACGGACCCCCTTTATATGGTAGGCATTACTTCATCGGCAGTCACCTTTTCATGCCTTGGCGTTTGCTTTACAGCTTGGGTTCTCAT CATGGCGTATGCGTGGCTTCCTGCAGACTCGACCCGGATCCGGGGATGGTTCCTTGGTCTTCCTTCGAGGCCGGGCCCAATGACTGGGATTGCAACACAGGAAGCGCACAATCCATCGCATCAGCATGTTCTCAATCCATTTGACATGATCAAAAGCGAGAGCCTCGAAATTATTCTCGAGCGTTACTTTGACGAGAATCCAGTTCTCATTTCTAGAGAGCGCCGCTTCCGCAAAGTATTCATGCAGCAGCTCAGCACTGCTCCGAAACCAAAGCTCCGGAAGAGCCAAATGATGCTCTTGCAGGCCACGGGCATCTCCTCGCGCATTCTCTTCGAGAACCCAGTTCCTGAGCCTCCCACGCCAATGACTGCCGGCACAGCAAATGAGGCCGATGGCGAGGAGAATTACCTCGAGAGTTCTGAGACTCGTCAGGTCTACGCTGACTCGGCCGTGTCACTCGCGAGTAACCGCTCTAGCCGCCTTCGCACGATCCAGCGTCAGCTTTTAAGCCACGTCTGCGTCATCGAGACAGAGATTGCCCTCTTTAACTTTGCTGCGCTCGCATACAAGGTTGGAAACGAAGCATGGGCGACTCCTCCCCCGGAGCAATCTGAACTGGTTGCCTCCGCTCCAGAGTACAAGCTTCTGCGGCACATTGTTGACGAAAAGCTTGATACTCACGTCATCGTCGCCAAGAGCGCAGACCGCATCATCATCTCCTTTCGTGGCACCGTTTCTTCGCTCAACGTGGACACCGACTTTGACTGGAAGCTCGAACGATATGATCAGGCCTGCGAAGTCGAGCCATTGCCGAGCACGACCCCGCGTGAGCGCTTCTGGAGCGAAAAGGAACCCACGGTGCATCGCGGTTTTCAAATTGCATATGCCGGAGTGAGAGAGGCATTGCACGAACTCGTTGACCCGCTCATTTCCCCGCGAATTGGACCTGACGGAAGGCTTCGACAGCGTCGCGCAGTTCTCTGCTCGGGTCACTCCCTGGGTGGTGCACTTGCTGTTATCTGTGCCTTTGACTTTGCCTGCTATCTCGACTCGGTCCTGTCCGATTCTGAAAGACCTGCGGTGGGTTGCACTACATTTGGCTGTCCACGCATCGGCTCGTACTCCTTTCTCATGCGCTATCGTCGCATGGTGCCCTCCACGAAGCGATTCGTTCTCGCAAGCGACATCATTCCCAAGACGCCCCCACGCTTATTCAAGGGCCAATACGCTGGCTACCATCACATTGGCACTGAATTTTTGCTGGACCTCAATGGAAACCTTCTCATTTCTCCGCACATGGTTGAGCGCGCGATATTGCATGGCCTTCGAAGCGTCAAGTCGCGTATGCACTTTGCCTCTCTGTACACTCTTGCCCTCGCGCTGTGGTGCTCACGCATGAAGATTGAACCTGATCTCTGGGTGGTCCACATTACAGATACGTTGAAATACGCCAAGGCAGACATTCTTAGCCGGCACGAAGAGCTTTTTCGCGCCTCCTATAATATCTTCAATAGAGAGGGTGTAATTTACGACCTTAATGTGGCGCCACGACGCAACATTGGGATCCAGGTCGACCCCGAGGAAGTTTCCGAGCACGAAGAGGAAGTCAAGCCTTTTATGCCGCGACATCGCTCGGCCCCCGTTCGTCTTTCGTCCACGGAAGCGACACGACTCGATCAGGCTCTCAACTTTGCAATTAGCACCCACGGGGAGCGCGACCCGAGCACCCTCACGCTGGACCAGCTGCGCTCGCTGCGGATCCTTGTAAAGGCGACGGCGGAGCACCGGCCGCACCTATAA。

4.权利要求1‑3中任一项所述的一种裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法,其特征在于,该方法包括依次进行的以下步骤:

S1.构建重组质粒pBS‑Zeo‑LE1

克隆来源于裂殖壶菌HX‑308的奇数链脂肪酸甘油酯脂肪酶基因LE1的上游和下游片段,通过基因同源重组技术将该基因插入pBS‑Zeo质粒中,构建得敲除载体pBS‑Zeo‑LE1;

S2.构建重组质粒pBS‑Zeo‑LE2

克隆来源于裂殖壶菌HX‑308的多不饱和脂肪酸甘油酯脂肪酶基因LE2的上游和下游片段,并通过基因同源重组技术将该基因插入pBS‑Zeo质粒中,构建敲除载体pBS‑Zeo‑LE2;

S3.构建裂殖壶菌基因工程菌株

利用电转化法将线性化后的重组质粒pBS‑Zeo‑LE1和pBS‑Zeo‑LE2电转导入裂殖壶菌HX‑308,即得所述裂殖壶菌基因工程菌株。

5.根据权利要求1‑3中任一项所述的一种裂殖壶菌基因工程菌株的应用,其特征在于,所述裂殖壶菌基因工程菌株通过发酵生产奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸。

6.根据权利要求5所述的一种裂殖壶菌基因工程菌株的应用,其特征在于,所述发酵生产的方法为,将所述裂殖壶菌基因工程菌株活化后,得发酵用菌种,将发酵用菌种接种于发酵培养基中进行发酵培养,收集菌体提取奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸。

7.根据权利要求6所述的一种裂殖壶菌基因工程菌株的一种应用,其特征在于,所述活化是将裂殖壶菌基因工程菌株接种于种子培养基中,连续培养三次。

8.根据权利要求7所述的一种裂殖壶菌基因工程菌株的一种应用,其特征在于,所述培养是在25~30℃,150~250r/min振摇培养的条件下进行的。

9.根据权利要求6~8中任一项所述的一种裂殖壶菌基因工程菌株的一种应用,其特征在于,所述收集菌体提取奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸的方法包括依次进行的以下步骤:

S1.向发酵培养结束后的发酵液中加入NaOH溶液将PH值调至11~14,加入破壁酶,于40~60℃,100~200r/min条件下振荡5~15h,得液体X;

S2.将液体X冷却至20~30℃后,加入与液体X等体积的无水乙醇,得液体Y;

S3.液体Y中加入正己烷萃取,收集上层有机相,重复提取3~5次,合并有机相,蒸发溶剂,得到含奇数链脂肪酸和多不饱和脂肪酸的油脂。