1.一种非诊断和治疗目的的无标记荧光检测FEN1活性的方法,其特征在于,所述检测方法涉及环形DNA底物、引物1及引物2;所述环形DNA底物由带5’分枝结构的挂锁探针与辅助探针杂交形成;
所述检测方法包括以下步骤:将环形DNA底物投入待测样品中混合孵育诱导裂解,裂解后所述环形DNA底物中分支结构被切除暴露出5’端磷酸基团的缺口;将裂解反应产物与DNA连接酶混合,通过DNA连接酶对上述缺口进行连接获得闭合的环形序列;将连接反应产物、核酸外切酶I及核酸外切酶III混合,对环形DNA底物中的辅助探针进行消化;将消化反应产物、引物1和引物2及dNTPs混合升温孵育一段时间后加入DNA聚合酶,以闭合的环形序列为模板引发超支化滚环扩增,对扩增产物进行定量检测即可获得FEN1活性;
所述的检测方法中,所述环形DNA底物由挂锁探针及辅助探针杂交形成,所述挂锁探针5’端向3’端方向为一段单核苷酸链及环形序列,所述单核苷酸链即为分支结构,所述环形序列两个末端与辅助探针配对,在辅助探针的作用下成环,形成挂锁探针;
所述环形DNA底物的制备方式如下:将挂锁探针及辅助探针加入含MgCl2的Tris缓冲液中加热孵育,孵育完成后缓慢冷却至室温形成;所述孵育温度为90~100℃,所述孵育时间为3~8min;
或,所述引物1能够识别并结合挂锁探针的环形序列并进行延伸,所述引物2能够识别上述延伸序列实现超支化滚环扩增;
所述挂锁探针、辅助探针、引物1及引物2的序列分别如下:挂锁探针:TTT TAG AAC TAT ATT GTC TTT CTC TGA TTC TGA CTC GTC ATG TCT CAGCTT TAG TTT AAT ACG ACT CCA TAG GGC TCA GTG TGA TTC CAC CTT CTC CAA;辅助探针:CAG AGA AAG ACA ATA TAG TTC TTG GAG AAG GTG GAA TCA CAC TGA G;引物1:CTA AAG CTG AGA CAT GAC GAG TC;引物2:CTC AGT GTG ATT CCA CCT TCT CC。
2.如权利要求1所述无标记荧光检测FEN1活性的方法,其特征在于,所述诱导裂解的反应中,孵育温度为50~60℃,孵育时间为25~35min;
或,所述DNA连接酶为Taq DNA连接酶,所述连接反应的温度为40~50℃,反应时间为25~35min;
或,所述消化反应的温度为34~40℃,反应时间为25~35min,随后在75~85℃下反应15~25min终止反应;
或,所述滚环扩增反应温度为60~70℃,反应时间为80~100min;
或,所述DNA聚合酶为Vent(exo-)DNA聚合酶;
或,所述定量检测方式为荧光定量检测。
3.如权利要求2所述无标记荧光检测FEN1活性的方法,其特征在于,所述定量检测方式如下:将滚环扩增产物与荧光染料混合,通过荧光光谱仪测量荧光发射光谱;
或,所述定量检测方式如下:以SYBR Gold作为荧光指示剂,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析滚环扩增反应产物。
4.如权利要求3所述无标记荧光检测FEN1活性的方法,其特征在于,所述荧光染料为SYBR Green I,在488 nm的激发波长下,在500-650 nm范围内记录发射光谱。
5.一种用于FEN1检测的试剂组合,其特征在于,所述检测试剂中至少包括DNA连接酶、DNA聚合酶、探针及引物;所述探针和引物如权利要求1所示。
6.如权利要求5所述用于FEN1检测的试剂组合,其特征在于,所述检测试剂中还包括缓冲液。
7.如权利要求6所述用于FEN1检测的试剂组合,其特征在于,所述缓冲液至少包括缓冲液A、缓冲液B、缓冲液C、及缓冲液D;
所述缓冲液A为15~25mM的Tris-HCl缓冲液,其中还具有 (NH4)2SO4、KCl、MgSO4及Triton-X-100;
所述缓冲液B为15~25mM的Tris-HCl缓冲液,其中还具有醋酸钾、醋酸镁、NAD、DTT及Triton X-100;
所述缓冲液C为60~70 mM的甘氨酸-KOH缓冲液,其中还具有MgCl2及β-ME;
所述缓冲液D为5~15mM的Bis-Tris-Propaneuc-HCl缓冲液,其中还具有MgCl2及DTT。
8.如权利要求6所述用于FEN1检测的试剂组合,其特征在于,所述试剂组合中还包括定量相关的试剂。
9.如权利要求8所述用于FEN1检测的试剂组合,其特征在于,采用荧光检测进行定量,所述定量相关试剂包括荧光染料。
10.如权利要求9所述用于FEN1检测的试剂组合,其特征在于,所述荧光染料为SYBRGreen I或SYBR Gold。
11.权利要求1-4任一项所述非诊断和治疗目的的无标记荧光检测FEN1活性的方法和/或权利要求5-10任一项所述用于FEN1检测的试剂组合在FEN1定量检测领域的应用;
所述在FEN1定量检测领域的应用包括以下任意一个方面:(1)FEN1相关检测产品的制备;
(2)样品中FEN1含量的测定;
(3)FEN1抑制剂/激动剂的筛选。
12.如权利要求11所述非诊断和治疗目的的无标记荧光检测FEN1活性的方法和/或用于FEN1检测的试剂组合在FEN1定量检测领域的应用,其特征在于:所述第(1)方面的应用中,所述FEN1相关的检测产品包括检测试剂盒或检测仪器;
所述第(2)方面的应用中,所述样品为细胞核提取物;
所述第(3)方面的应用中,所述FEN1抑制剂/激动剂的筛选方式如下:将待测的抑制剂或激动剂加入已知浓度的FEN1样品中,并对加样后样品中FEN1的活性进行测定。
13.如权利要求12所述的应用,其特征在于,所述第(2)方面的应用中,所述样品为肿瘤细胞核提取物。