1.一种精子质量多参数检测试剂盒,其特征在于,包括:偶联有荧光标记物的Annexin V复合物、溴化乙锭染料、吖啶橙染料、酸化液和缓冲液;所述荧光标记物为可在波长为200‑
400nm的激发光的激发下产生绿色荧光的碳量子点。
2.根据权利要求1所述的精子质量多参数检测试剂盒,其特征在于,所述碳量子点通过以下方法制备得到:
1‑1)将番茄红素、二硫苏糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中,再加入乙二胺,搅拌;
1‑2)将步骤1‑1)得到的溶液转移到反应釜中,加热反应;
1‑3)反应结束后,将产物过滤,滤液干燥得到粗产品;
1‑4)将粗产品溶于超纯水中,离心,将离心液透析,收集透析袋内溶液,冷冻干燥,即得所述碳量子点。
3.根据权利要求2所述的精子质量多参数检测试剂盒,其特征在于,所述碳量子点通过以下方法制备得到:
1‑1)将番茄红素、二硫苏糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中,超声搅拌至澄清,再加入乙二胺,搅拌1‑3分钟;
1‑2)将步骤1‑1)得到的溶液转移到聚四氟乙烯为内衬的反应釜中,在烘箱中加热至
130℃‑160℃下持续反应4‑12小时;
1‑3)反应结束后,待产物冷却至室温,再用滤膜过滤产物,将滤液冷冻干燥得到粗产品;
1‑4)将粗产品溶于超纯水中,离心,取滤液用截断分子量为800‑1500Da的透析袋透析
8‑16小时,收集透析袋内溶液,冷冻干燥,即得所述碳量子点。
4.根据权利要求3所述的精子质量多参数检测试剂盒,其特征在于,其中,偶联有荧光化合物的Annexin V复合物通过以下方法制备得到:
2‑1)将碳量子点加入到PBS缓冲液中,搅拌溶解,然后加入EDC和NHS,活化;
2‑2)将Annexin V试剂加入到步骤2‑1)得到的溶液中,37℃下摇床反应,反应产物纯化后得到该Annexin V复合物溶液。
5.根据权利要求1所述的精子质量多参数检测试剂盒,其特征在于,其中,偶联有荧光化合物的Annexin V复合物通过以下方法制备得到:
2‑1)将10mg碳量子点加入到10mLPBS缓冲液中,搅拌溶解,然后加入200μL浓度为2mg/mL的EDC和60μL浓度为2mg/mL的NHS,30℃下活化20min;
2‑2)将20mg Annexin V试剂加入到步骤2‑1)得到的溶液中,37℃下摇床反应18小时,反应产物纯化后得到该Annexin V复合物溶液。
6.根据权利要求5所述的精子质量多参数检测试剂盒,其特征在于,其中,所述酸化液包括:0.05‑0.2mol/L的盐酸、0.1‑0.5mol/L的氯化钠、质量分数0.02‑0.2%的曲拉通X‑
100;
所述缓冲液包括:0.1‑0.5mol/L的氯化钠、0.2‑2mmol/L的乙二胺四乙酸、0.01‑
0.05mol/L十二烷基肌氨酸钠、0.05‑0.2mol/L柠檬酸和0.1‑0.5mol/L磷酸氢二钠。
7.根据权利要求6所述的精子质量多参数检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒还包括RNA酶液,RNA酶液的pH值为7.4;该RNA酶液包括:10‑100mg/mL的RNase A、50mmol/L的Tris‑HCL、体积百分比为40‑60%的甘油以及0.1mol/L的KCl。
8.根据权利要求1‑7中任意一项所述的精子质量多参数检测试剂盒,其特征在于,使用该试剂盒对精子质量进行检测的方法包括以下步骤:S1、用缓冲液将精子样品稀释,得到精子稀释液;
S2、将Annexin V复合物溶液加入到步骤S1得到溶液中,混匀后孵育;
S3、向步骤S2得到的混合物中加入溴化乙锭染料,混匀后孵育;
S4、向步骤S3得到的产物中加入缓冲液,混匀,然后加入酸化液,处理10‑60秒后加入吖啶橙染料,混匀得到待测试样;
S5、利用流式细胞仪对待测试样进行检测,收集待测试样的蓝色、橙红色、绿色和红色荧光;
S6、结合四种荧光检测结果进行分析:先通过蓝色荧光分析出细胞膜保持完整的凋亡细胞的比例,通过橙红色荧光分析出细胞膜损坏的坏死细胞的比例,从而得到细胞活率;在上述基础上,根据绿色荧光和红色荧光分析得到活精子细胞中的DNA碎片率。
9.根据权利要求8所述的精子质量多参数检测试剂盒,其特征在于,其中,所述步骤S1为:用缓冲液将精子样品稀释,得到精子稀释液,然后向其中加入RNA酶液,消化处理5‑
25min。
10.根据权利要求8或9所述的精子质量多参数检测试剂盒,其特征在于,所述步骤S2中,先利用流式细胞仪检测Annexin V复合物的蓝色荧光强度F1,然后将Annexin V复合物加入到步骤S1得到产物中,混匀后孵育;
所述步骤S6中,还根据待测试样的蓝色荧光的强度F2与Annexin V复合物溶液的蓝色荧光强度F1的差值分析出精子的ROS含量。