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专利号: 2021116625633
申请人: 无锡代际生物科技有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-05-07
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种活动精子DNA碎片检测试剂盒,其特征在于,包括:Pi检测试剂,其为荧光物质与银的络合物,当Pi存在时,Pi取代络合物中的银,使得被猝灭的荧光物质恢复荧光;

酸化液,其包括:0.05‑0.2mol/L的盐酸、0.1‑0.5mol/L的氯化钠和质量分数0.02‑

0.2%的曲拉通X‑100;

缓冲液,其包括:0.1‑0.5mol/L的氯化钠、0.2‑2mmol/L的乙二胺四乙酸、0.005‑

0.03mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.05‑0.2mol/L的磷酸氢二钠和0.05‑0.2mol/L的柠檬酸;

以及吖啶橙染色液;

所述荧光物质为碳量子点,所述碳量子点通过以下方法制备得到:

1)将番茄红素、二硫苏糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中,超声搅拌至澄清,再加入乙二胺,搅拌1‑3分钟;

2)将步骤1)得到的溶液转移到聚四氟乙烯为内衬的反应釜中,在烘箱中加热至130℃‑

160℃下持续反应4‑12小时;

3)反应结束后,待产物冷却至室温,再用滤膜过滤产物,将滤液冷冻干燥得到粗产品;

4)将粗产品溶于超纯水中,离心,取滤液用截断分子量为800‑1500Da的透析袋透析8‑

16小时,收集透析袋内溶液,冷冻干燥,即得所述碳量子点;

所述Pi检测试剂的制备方法为:将碳量子点溶于去离子水中,搅拌溶解,配置成10μg/mL的碳量子点溶液,然后再加入足量的硝酸银,混合得到Pi检测试剂,避光保存。

2.根据权利要求1所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒,其特征在于,使用所述试剂盒对活动精子进行检测的方法包括以下检测步骤:S1、用缓冲液将精子样品稀释,得到精子稀释液;

S2、向精子稀释液中酸化液,处理15‑120s;

S3、向步骤S2得到的产物中加入缓冲液,然后加入Pi检测试剂,漩涡混匀,反应5‑

60min;

S4、向步骤S3得到的产物中加入吖啶橙染色液,混匀;

S5、将步骤S4得到的产物上流式细胞仪检测,收集精子的蓝色、绿色和红色荧光;

结合三种荧光检测结果进行分析:先通过蓝色荧光检测出活动的精子,然后根据绿色荧光和红色荧光分析得到活动的精子中的DNA碎片率。

3.根据权利要求2所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒,其特征在于,所述检测步骤为:

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S1、用缓冲液将精子样品稀释至1×10‑5×10个/mL,得到精子稀释液;

S2、取500μL精子稀释液,向其中加入350μL酸化液,处理30s;

S3、向步骤S2得到的产物中加入8μL缓冲液,混匀,然后加入40μL的Pi检测试剂,漩涡混匀,反应15min;

S4、向步骤S3得到的产物中加入10μL吖啶橙染色液,混匀,孵育2min;

S5、将步骤S4得到的产物上流式细胞仪检测,收集精子的蓝色、绿色和红色荧光;

结合三种荧光检测结果进行分析:先通过蓝色荧光检测出活动的精子,然后根据绿色荧光和红色荧光分析得到活动的精子中的DNA碎片率。

4.根据权利要求3所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒,其特征在于,其中,在Pi存在的条件下,Pi检测试剂在波长为200‑400nm的激发光的激发下产生蓝色荧光。