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专利号: 2021115605115
申请人: 湖南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR引物和探针,其特征在于包括:针对猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因PCV2‑cap、PCV3‑cap、PPV‑NS1和PRV‑gE的保守片段的引物和探针,具体的包括:检测猪圆环病毒2型的上游引物、下游引物和探针,它们的序列分别为:

5’‑TGTTTTCGAACGCAGTGC‑3’

5’‑ACTACTCCTCCCGCCATA ‑3’FAM‑5'‑CCAGCCCTTCTCCTACCACTCCC‑3’‑Tamra;

检测猪圆环病毒3型的上游引物、下游引物和探针,它们的序列分别为:

5'‑TGGTAGTTCCCGCCAGAA‑3’

5'‑TACGGGCACACAGCCATA‑3’VIC‑5'‑GACGGCGCCTGGACCACAAACA‑3’‑Tamra;

检测猪细小病毒的上游引物、下游引物和探针,它们的序列分别为:

5'‑CAACTACGCAGCAACTCC‑3’

5'‑CGTATTGCTGAATCTGGC‑3’ROX‑5'‑TGGCTCGCTCCACGGCTCC‑3’‑BHQ2;

检测猪伪狂犬病毒的上游引物、下游引物和探针,它们的序列分别为:

5'‑CTCCTTCGTGATGACGTG‑3’

5'‑TACACCGGKGAGAGCATG‑3’Cy5‑5'‑CGCGTCGGCACCCGGAA‑3’‑BHQ3。

2.同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法,其特征在于包括如下步骤:

(1)DNA提取:提取待检测样品的总DNA,作为反应模板;

(2)预混体系配制:配制所需的预混体系,所述预混体系中含有权利要求1所述的引物和探针;

(3)反应组分配制:于预混体系中分别加入阴性对照物、阳性对照物和待检测样品,得到阴性对照组、阳性对照组和待检测样品组;

(4)扩增:将阴性对照组、阳性对照组和待检测样品组放入荧光PCR仪器中进行扩增,采集FAM、VIC、ROX及Cy5四个通道的荧光信号;

(5)结果有效性分析;

(6)待检测样品的结果判定。

3.如权利要求2所述的同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法,其特征在于所述步骤(3)中,将猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的四个基因PCV2‑cap、PCV3‑cap、PPV‑NS1和PRV‑gE串联入克隆载体构建成一个独立的重组质粒作为阳性对照物。

4.如权利要求3所述的同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法,其特征在于所述阳性对照物含有PCV2‑cap基因片段、PCV3‑cap基因片段、PPV‑NS1基因片段、PRV‑gE基因片段;所述PCV2‑cap基因片段的序列如SEQ ID NO.13所示,所述PCV3‑cap基因片段的序列如SEQ ID NO.14所示,所述PPV‑NS1基因片段的序列如SEQ ID NO.15所示,所述PRV‑gE基因片段的序列如SEQ ID NO.16所示。

5.如权利要求2所述的同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法,其特征在于所述步骤(4)中,扩增的参数为,首先95℃预变性5min;再进行45个循环:95℃下变性10s,60℃下退火延伸30s。

6.如权利要求2所述的同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法,其特征在于所述步骤(5)中,根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数Ct值判定结果的有效性,当满足以下条件:

四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5下的阳性对照的Ct值均小于30,且四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5下的阴性对照的Ct值大于38或无Ct值,则结果有效;否则结果无效,需要重复样品的检测。

7.如权利要求6所述的同时检测四种猪繁殖障碍病原的多重荧光定量PCR检测方法,其特征在于所述步骤(6)待检测样品的结果判定具体为:当样品的四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5的Ct值至少有一个小于等于38,且出现典型的扩增曲线,则样品为相关病毒阳性,表明样品中存在相关病毒的单一或混合感染;

当样品的四个荧光信号FAM、VIC、ROX、Cy5的Ct值均大于38或/和无扩增曲线,则表明样品中无四种相关病毒感染。