1.一种应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤1、设计可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA;
步骤2、构建蛋白质核酸复合物;
将重组蛋白Cas9与可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA组装为蛋白质核酸复合物;
步骤3、构建含有GFP11序列的单链DNA序列;
在GFP11序列的左右两端分别添加一段碱基序列,该段碱基序列与LGR5部分序列同源;
步骤4、构建稳定表达GFP1‑10的胶质瘤干细胞GSCs;
步骤5、利用共转染技术将步骤2构建的蛋白质核酸复合物与步骤3构建的含有GFP11的单链DNA序列共同转入到步骤4构建的稳定表达GFP1‑10的胶质瘤干细胞GSCs中,GFP1‑10蛋白和GFP11蛋白整合成一个完整的,具有发光功能的绿色荧光蛋白,实现胶质瘤干细胞中内源LGR5蛋白标记。
2.根据权利要求1所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法,其特征在于:步骤1中可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA通过下述步骤获得:
步骤1.1、合成含有LGR5靶点的引物;
步骤1.2、通过sgRNA体外转录试剂盒(Inovogen),采用T7 RNA聚合酶复合物在体外转录sgRNA。
3.根据权利要求2所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法,其特征在于,步骤1中可靶向LGR5基因的体外转录的sgRNA序列为:LGR5 C端(2000‑2724bp):TGAGAAAGCAAACCTACGTCTGG;
LGR5第一个环(500‑1020bp):ATGAATTCCCCACTGCAATTAGG;
LGR5两环之间(1081‑1680bp):GAAAGATGCTGGAATGTTTCAGG。
4.根据权利要求1‑3任一所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法,其特征在于,步骤3中含有GFP11序列的单链DNA序列具体为:左臂序列(LGR5 C端):
TCCTGCATGTCTCAATCCCCTTCTCTACATCTTGTTCAATCCTCACTTTAAGGAGGATCTGGTGAGCCTGA;
右臂序列(LGR5 C端):
AGCAAACCTACGTCTGGACAAGATCAAAACACCCAAGCTTGATGTCAATTAACTCTGATGATGTCGAAAA;
供体序列(LGR5 C端):
TCCTGCATGTCTCAATCCCCTTCTCTACATCTTGTTCAATCCTCACTTTAAGGAGGATCTGGTGAGCCTGAATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCAGCAAACCTACGTCTGGACAAGATCAAAACACCCAAGCTTGATGTCAATTAACTCTGATGATGTCGAAAA;
左臂序列(LGR5第一个环):
CCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGCTCCACAGCCTAGAGACTTTAGATTTAAATTACAATAACCTTG;
右臂序列(LGR5第一个环):
AATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAAGAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTC;
供体序列(LGR5第一个环):
CCCTGGGAAAGAAATGCTTTGATGGGCTCCACAGCCTAGAGACTTTAGATTTAAATTACAATAACCTTGATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCAATTCCCCACTGCAATTAGGACACTCTCCAACCTTAAAGAACTAGGATTTCATAGCAACAATATCAGGTC;
左臂序列(LGR5两环之间):
TGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAACAGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAG右臂序列(LGR5两环之间):CTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGTGACCTTGAAGATTTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAA;
供体序列(LGR5两环之间):
TGCCTATAAGATTTCTAATCAATGGAATAAAGGTGACAACAGCAGTATGGACGACCTTCATAAGAAAGATGCGTGACCACATGGTCCTTCATGAGTATGTAAATGCTGCTGGGATTACAGGTGGCGGCCTGGAATGTTTCAGGCTCAAGATGAACGTGACCTTGAAGATTTCCTGCTTGACTTTGAGGAAGACCTGAA。
5.根据权利要求4所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法,其特征在于,步骤4具体为:将含有GFP1‑10 cDNA的质粒转GSCs(U3082MG、U3117MG),之后筛选稳定表达GFP1‑10蛋白的GSCs。
6.根据权利要求5所述的应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法,其特征在于,步骤5具体为:通过电穿孔法将蛋白质核酸复合物和含有GFP11的单链DNA序列共同转入到稳定表达GFP1‑10蛋白的GSCs中。
7.一种用于标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的试剂盒,其特征在于:包括蛋白质核酸复合物、含有GFP11序列的单链DNA序列及稳定表达GFP1‑10的胶质瘤干细胞GSCs;其中蛋白质核酸复合物为权利要求1‑6任一所述应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法中步骤2所述的蛋白质核酸复合物;含有GFP11序列的单链DNA序列为权利要求1‑6任一所述应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法中步骤3所述的含有GFP11序列的单链DNA序列;稳定表达GFP1‑10的胶质瘤干细胞GSCs为权利要求1‑6任一所述应用CRISPR/Cas9和split GFP双分子荧光互补技术标记胶质瘤干细胞标志物LGR5的方法中步骤4所述的稳定表达GFP1‑10的胶质瘤干细胞GSCs。