1.一种非治疗目的的高表达miR‑146a‑5p的外泌体抑制THP‑1分化和巨噬细胞M1极化的方法,其特征在于,包括以下步骤:S1、高表达miR‑146a‑5p外泌体的制备,具体为:
(1)将HepG2细胞接种在10cm细胞培养皿中,细胞生长12h后,使用RiboFECTTMCP Reagent分别将50nmol/L miR‑146a‑5p mimic或阴性对照转染至HepG2细胞中,转染48h后收集细胞培养基上清进行外泌体制备;
(2)对细胞培养基以300g和2000g转速进行分次离心20min以消除大的死亡细胞和细胞碎片,每次离心完成后去掉沉淀,保留上清进行下一次离心;然后将得到的上清以20000g转速离心30min以去除较大的微囊泡;然后将得到的上清液以100,000g转度离心70min以收集外泌体沉淀,用6ml PBS清洗外泌体沉淀一次,100,000g转度离心70min得到高表达miR‑
146a‑5p的外泌体和对照组外泌体;
S2、外泌体的鉴定,具体为:
(1)取20μl提取完成的外泌体溶液,通过透射电子显微镜镜下观察并拍照记录外泌体的形态;
(2)取20μl提取完成的外泌体悬液至新的1.5ml的EP管,加入20μlRIPA,裂解充分后,按
4:1的比例加入5×SDS溶液,置于100℃水浴中煮沸5min,收取蛋白样品进行电泳,检测外泌体标记蛋白CD63的表达情况;
(3)从外泌体中分离总RNA,将miRNA逆转录为cDNA,以U6为内参,定量miR‑146a‑5p的表达;
S3、细胞的培养:HepG2在添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养,THP‑1在含10%胎牛血清的RPMI‑1640培养基中培养,两种细胞均在37℃,5%CO2培养箱中进行培养;然后向悬浮培养的THP‑1细胞中加入PMA至终浓度为100ng/ml以诱导THP‑1分化为巨噬细胞;
S4、外泌体miR‑146a‑5p与THP‑1或巨噬细胞共孵育:将高表达miR‑146a‑5p的外泌体或对照组外泌体加入至THP‑1或THP‑1分化的巨噬细胞中共孵育48h;以U6为内参,定量THP‑1和巨噬细胞内miR‑146a‑5p的表达;以18S为内参,定量巨噬细胞内MCP‑1、TNF‑a、IL‑6的表达;收集细胞样品于1.5mLEP管中,RIPA裂解充分后,以4:1加入5×SDS,获取蛋白样品,电泳完后,检测THP‑1细胞内CD68和巨噬细胞内CD86的表达情况;
S5、实验结果的分析。
2.根据权利要求1所述的一种非治疗目的的高表达miR‑146a‑5p的外泌体抑制THP‑1分化和巨噬细胞M1极化的方法,其特征在于,所述步骤S5具体为:(1)与对照组相比,Mimic‑146a‑5p组HepG2细胞内和细胞培养上清的外泌体中miR‑
146a‑5p的表达均明显升高;
(2)高表达miR‑146a‑5p的外泌体与THP‑1或巨噬细胞共孵育48h后,THP‑1或巨噬细胞内miR‑146a‑5p的表达明显升高;
(3)高表达miR‑146a‑5p的外泌体可以减少巨噬细胞促炎因子MCP‑1、TNF‑a、IL‑6的释放;
(4)高表达miR‑146a‑5p的外泌体可以降低THP‑1细胞内巨噬细胞标志物CD68的表达;
(5)高表达miR‑146a‑5p的外泌体可以降低M1型巨噬细胞标志物CD86的表达。