1.一种从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)提取:称取刀豆并研磨成粉,过筛后加入提取液,室温下将刀豆粉末和提取液充分搅拌均匀,使刀豆粉末中的脲酶和刀豆凝集素充分浸出,在室温下将混合物进行离心,收集上层清液;
2)PEG沉淀:在室温条件下向得到的上清液中低速缓慢加入PEG溶液混合均匀,将溶液转移至冰箱中静置,之后进行离心,移除上层清液收集下层的沉淀;
3)SephadexG~50凝胶层析:对SephadexG~50凝胶柱使用平衡Buffer进行平衡,向得到的沉淀中加入Wash Buffer重悬,进行抽滤后将重悬后的液体使用SephadexG~50凝胶进行层析并依次使用Wash Buffer冲洗、Elution Buffer进行洗脱,Wash Buffer冲洗流出的液体为刀豆脲酶溶液,之后通过Elution Buffer洗脱收集到的洗脱液为刀豆凝集素溶液;
4)硫酸铵沉淀:向得到的刀豆脲酶溶液、刀豆凝集素溶液中分别低速缓慢加入硫酸铵固体粉末,待到硫酸铵粉末完全溶解后,将溶液转移至冰箱中静置进行沉淀,之后进行离心,移除上层清液收集下层的沉淀;
5)透析冻干:将得到的沉淀按照一定比例分别使用透析液进行溶解,之后进行离心,收集上清液,将收集到的上清液加入到透析袋中,再放置到冰箱中使用磁力搅拌器进行透析,透析结束后进行低温离心,离心结束后收集上层清液,对上层清液进行冷冻干燥得到刀豆脲酶晶体和刀豆凝集素晶体。
2.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法,其特征在于:步骤1)中,刀豆磨成粉后采用孔径80目的筛网进行筛分,筛除较大颗粒、保留粉末。
3.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法,其特征在于:步骤1)中,提取液的成分含有终浓度3%的PEG4000~8000、溶剂为25mM的柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液。
4.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法,其特征在于:步骤1)中,刀豆、提取液按照1g:5ml的料液比进行混合。
5.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法,其特征在于:步骤2)中,PEG溶液为PEG4000~PEG8000溶液,添加终浓度为10%。
6.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法,其特征在于:步骤2)中,下层沉淀进行重悬,重悬Buffer成分为50mM Tris‑HCl、5mg/ml甘氨酸、5mg/ml葡萄糖、30mg/ml山梨醇。
7.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法,其特征在于:步骤3)中,Wash Buffer成分为终浓度含有100mM NaCl的50mM柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液,Elution Buffer成分为终浓度含有100mM NaCl、100mM葡萄糖的50mM柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液。
8.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法,其特征在于:步骤4)中,所述刀豆脲酶溶液中硫酸铵的沉淀浓度为30%(m/v),所述刀豆凝集素溶液中硫酸铵的沉淀浓度为60%(m/v)。
9.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法,其特征在于:步骤4)中,所述冰箱静置沉淀时的温度设置为4℃,沉淀时间为16h;沉淀结束后的刀豆脲酶溶液需要再过一次Sephadex G~25凝胶层析进行脱盐去除硫酸铵。
10.根据权利要求1所述的从刀豆中同时提取脲酶和刀豆凝集素的方法,其特征在于:步骤5)中,所述脲酶透析的透析液成分为100mM氯化钠的50mM柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液,Con A透析的透析液成分为ddH2O,透析时间为每2h更换一次透析Buffer,进行3次,温度为4℃,磁力搅拌转速为700rpm;透析结束后低温离心;进行冷冻干燥是温度为‑60℃,时间为48h。