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专利号: 2021111911836
申请人: 浙江理工大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-06-16
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1. 一种圆锥铁线莲异戊烯基转移酶PT1基因的应用,其特征在于,所述圆锥铁线莲异戊烯基转移酶PT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,通过将该基因的表达载体转化到野生型拟南芥植物中进行过表达,从而提高植物抗紫外胁迫。

2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述提高植物抗紫外胁迫的具体表现为:‑

在植物受到紫外胁迫后,过表达PT1基因能降低叶片中的O2 生成速率、H2O2增加量、丙二醛增加量和电导率的增加。

3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述提高植物抗紫外胁迫的具体表现为:在植物受到极限紫外胁迫后,过表达PT1基因能增加植物的存活率。

4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述圆锥铁线莲异戊烯基转移酶PT1基因能作为培育强抗紫外胁迫植物的基因资源。

5.一种基于圆锥铁线莲异戊烯基转移酶PT1基因的过表达拟南芥株系的构建方法,其特征在于,具体如下:S1:利用Trizol法提取圆锥铁线莲RNA,反转录获得cDNA,利用高保真酶从cDNA模板中扩增如SEQ ID NO.1所示的PT1基因序列,以获得圆锥铁线莲异戊烯基转移酶PT1基因CDS片段;扩增PT1基因序列时采用的正向引物和反向引物为:, ,

正向引物:5‑ATGATTTCTGCTTTAGCTTCTCCA‑3, ,

反向引物:5‑TCAACAAACAAAGGGAATAAGCAAA‑3;

S2:构建含有圆锥铁线莲异戊烯基转移酶PT1基因编码区的表达载体,具体步骤如下:

1)利用DNA凝胶回收试剂盒对已连接同源臂的圆锥铁线莲异戊烯基转移酶PT1基因进行胶回收,获得纯化PCR产物;

2)利用限制性内切酶对所述PCR纯化产物和质粒进行酶切;

3)使用同源重组法将目的基因与载体pCAMBIA2302连接,通过热激法导入大肠杆菌中,经菌液PCR扩增、电泳和测序后获得含有目的基因的重组质粒,实现表达载体的构建;

S3:将所述表达载体通过农杆菌介导法转化到野生型拟南芥植株中,具体步骤如下:

1)使用冻融法将重组质粒导入农杆菌中,平板筛选获得阳性克隆菌株;

2)取阳性克隆的农杆菌菌液加入到液体LB培养基中连续扩繁两次,然后将菌块重悬浮并加入表面活性剂后搅拌均匀,将拟南芥花蕾浸入菌液浸花后,黑暗保湿放置,然后置于光照培养箱培养,待其生长成熟时收种;

3)培养浸花转化获得的拟南芥种子至幼苗生长出两片真叶,喷施Basta工作液,培养5~

15天后,将抗性单株移栽到新的基质中培养,待植株长出5 8片真叶时,分别提取野生型植~株与转基因型植株RNA,反转录获得cDNA后进行PCR扩增,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,以筛选获得过表达拟南芥T1代种子,进而得到过表达拟南芥株系。

6.根据权利要求5所述的构建方法,其特征在于,所述步骤S3中,将拟南芥花蕾浸入菌液浸花10~20s后,黑暗保湿放置24 48h。

~

7.根据权利要求5所述的构建方法,其特征在于,所述步骤S3中,Basta工作液的浓度为

0.001% 0.005%。

~

8. 根据权利要求5所述的构建方法,其特征在于,所述步骤S3中,利用Primer 5软件设计一对特异性引物:, ,

正向引物PT1yz1Fp:5‑GGCGGCAGCAACTATAACCA‑3, ,

反向引物PT1yz1Rp:5‑CTCCCTCAAACTTGACTTCAGCAC‑3进行过表达拟南芥T1代筛选,其中引物PT1yz1Fp在目标片段序列中设计,而PT1yz1Rp在目标载体序列上设计,使该特异引物能特异的检测出转化成功的拟南芥T1代单株,最终筛选出过表达拟南芥株系。