1.一种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2中和抗体定量检测试剂盒,由设在盒体内的包被有新冠病毒S1蛋白的微孔板1、包被有AXL蛋白和ACE2蛋白的微孔板2、中和抗体标准品溶液、阳性对照、阴性对照、样品稀释液、重组RBD+NTD蛋白酶结合物、20×浓缩洗涤液、显示液A、显示液B、终止液和说明书构成;
其特征在于:
所述微孔板1为聚苯乙烯微孔板,其各孔包被有浓度为1‑5μg/ml的新冠病毒S1蛋白;
所述微孔板2为聚苯乙烯微孔板,其各孔包被有浓度为1‑5μg/ml AXL蛋白即酪氨酸蛋白激酶受体UFO和2‑5μg/ml ACE2蛋白即血管紧张素转换酶2,其中所述AXL蛋白与ACE2蛋白在每微孔中包被比例量为1:2~1:4;
所述中和抗体标准品溶液为含RBD中和抗体和NTD中和抗体的混合液,其中RBD中和抗体与NTD中和抗体的摩尔比为2:1;该标准品溶液为浓度梯度分别是0AU/mL、0.1563AU/mL、
0.3125AU/mL、0.625AU/mL、1.25AU/mL、2.5AU/mL、5AU/mL的7个标准品溶液,其中0AU/mL为标准品缓冲液即:pH7.4磷酸盐缓冲液;
所述阳性对照为3ug/ml的RBD中和抗体和1ug/ml的NTD中和抗体的混合液;
所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS‑CoV‑2抗体阴性血清;
所述样品稀释液的配方是:除菌的1000mL纯水中,含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、CTAB 1g、BSA 5g、TritonX‑100 0.1mL、Proclin300 1mL,pH 7.4;
所述RBD+NTD蛋白酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组RBD+NTD蛋白酶结合物;该酶标酶结合物工作效价为1:7000,稀释液为酶结合物稀释液,该酶结合物稀释液的配方是:除菌的1000mL纯水中,含NaCl 8g、NaH2PO4·2H2O 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、BSA 3.5g、Proclin300 1mL;
所述20×浓缩洗涤液的配方是:除菌的50mL双蒸水中,含NaCl 8.0g、NaH2PO4·2H2O
0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、吐温20 0.5mL;
所述显示液A是浓度为0.3mg/mL的四甲基联苯胺(TMB)溶液;所述显示液B是浓度为
0.74mg/mL的过氧化脲溶液;使用时将显示液A与显示液B按体积比1﹕1混合;
所述终止液是浓度为2mol/L的硫酸溶液。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2中和抗体定量检测试剂盒,其特征在于:所述微孔板1各孔包被有浓度为3μg/ml的新冠病毒S1蛋白;所述微孔板2各孔包被有浓度为2μg/ml AXL蛋白即酪氨酸蛋白激酶受体UFO和4μg/ml ACE2蛋白即血管紧张素转换酶2,其中所述AXL蛋白与ACE2蛋白在每微孔中包被比例量为1:2。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2中和抗体定量检测试剂盒,其特征在于:所述的RBD中和抗体是利用灭活的新型冠状病毒感染者血清经过装有重组RBD蛋白偶联的琼脂糖微球层析柱过滤,RBD中和抗体会结合到琼脂糖微球上,经过洗杂、洗脱得到纯化的RBD中和抗体,经过效价检测和筛选,经测定的RBD中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合,通过CHO细胞重组表达获得;所述的NTD中和抗体是利用灭活的新型冠状病毒感染者血清经过装有重组NTD蛋白偶联的琼脂糖微球层析柱过滤,NTD中和抗体会结合到琼脂糖微球上,经过洗杂、洗脱得到纯化的NTD中和抗体,经过效价检测和筛选,经测定的NTD中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合,通过CHO细胞重组表达获得。
4.权利要求1所述新型冠状病毒SARS‑CoV‑2中和抗体定量检测试剂盒在检测含新型冠状病毒中和抗体生物样品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:所述检测新型冠状病毒中和抗体包括中和抗体含量测定和中和抗体亲和力测定;其中,所述中和抗体含量测定方法是:
(1)分别于微孔板1和微孔板2内每孔先加入25uL样品稀释液,再将待测样品各取25uL分别加入到微孔板含有样品稀释液的孔中;于微孔板1中,分别将0AU/mL、0.1563AU/mL、
0.3125AU/mL、0.625AU/mL、1.25AU/mL、2.5AU/mL、5AU/mL的7个标准品溶液各25uL加入至含有样品稀释液的孔中,37℃温浴30分钟;
(2)反应结束后,分别用洗涤液洗板5±1次,每次应浸泡20s~40s,每孔加液量不少于
350μL,洗涤完之后拍干;
(3)于微孔板1和微孔板2分别每孔再加入100uL RBD+NTD蛋白酶结合物,混匀后用不干胶封片封盖反应板,37℃温浴20分钟;
(4)反应结束后,分别用洗涤液洗板5±1次,每次应浸泡20s~40s,每孔加液量不少于
350μL,洗涤完之后拍干;
(5)于微孔板1和微孔板2分别先加入显色液A 50μL,再加入显色液B 50μL,37℃避光温浴10分钟;
(6)于微孔板1和微孔板2分别加入终止液50μL,终止反应,用酶标仪检测各孔在450nm和630nm双波长的吸光值;
(7)微孔板1计算结果方法是:以标准品的各浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,待测样品根据测得的OD值由标准曲线查出相应的浓度;或用标准品的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将待测样品的OD值代入方程式,计算出样品的浓度,再乘以稀释倍数,得到样品的实际浓度;
所述中和抗体亲和力测定方法是:
(1)于微孔板2内每孔先加入25uL样品稀释液,再将待测样品、阳性对照和阴性对照各取25uL分别加入到微孔板含有样品稀释液的孔中,再加入100uL RBD+NTD蛋白酶结合物,37℃温浴30分钟;
(2)反应结束后,分别用洗涤液洗板5±1次,每次应浸泡20s~40s,每孔加液量不少于
350μL,洗涤完之后拍干;
(3)于微孔板先加入显色液A 100μL,再加入显色液B 100μL,37℃避光温浴10分钟;
(4)于微孔板加入终止液50μL,终止反应,用酶标仪检测各孔在450nm和630nm双波长的吸光值;
(5)微孔板2计算结果方法是:根据吸光值计算抑制率,并判断结果;
结果判定标准:S/CO≥30%:新型冠状病毒中和抗体阳性,S/CO<30%:新型冠状病毒中和抗体阴性。