1.一种用于检测猫冠状病毒抗体的间接ELISA试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中含有包被抗原S重组蛋白;所述S重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述S重组蛋白的制备方法,包括以下步骤:(a)以猫冠状病毒S蛋白基因为模板进行PCR扩增,克隆出S重组蛋白片段;
(b)将所述S重组蛋白片段进行电泳分离,回收纯化后连接至载体上,并转化至感受态细胞,得到第一重组质粒;双酶切电泳检测,将电泳鉴定正确的第一重组质粒进行测序;
(c)将上述步骤(b)测序正确的第一重组质粒和原核表达载体pET‑28a连接,得到重组质粒pET28a‑FCoV‑S;
(d)将所述重组质粒pET28a‑FCoV‑S转化至大肠杆菌感受态细胞BL21进行原核表达,得到FCoV‑S重组蛋白,即猫冠状病毒S重组蛋白;
(e)将原核表达的菌液超声后离心获得包涵体沉淀,进行包涵体变性,变性后的上清液通过His‑Trap柱亲和层析,收集过柱后的液体,经过复性缓冲液梯度透析,最后收集上清,得到纯化的FCoV‑S重组蛋白。
3.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述步骤(a)中,所述PCR扩增:上游引物序列如SEQ ID NO:2所示;下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。
4.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述步骤(a)中,所述PCR扩增:PCR扩增反应体系为:扩增体系为25 μL,其中2×TransStart FastPfu PCR SuperMix12.5 μL、上下游引物各 1μL、模板 1 μL,补充灭菌 ddH2O 至终体积 25 μL。
5.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述步骤(a)中,所述PCR扩增:PCR扩增反应条件为:94℃预变性 2 min 后进入循环,94℃变性20s;55℃退火 20 s,72℃延伸 1 min,35 个循环;72℃终延伸5 min。
6.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述步骤(b)中,所述感受态细胞为大肠杆菌感受态细胞DH5α;所述双酶切的位点分别为Nde Ⅰ和Xho Ⅰ。
7.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括ELISA板、阳性对照血清、阴性对照血清、洗涤液、血清样本稀释液、酶标抗体工作液、显色液和终止液。
8.如权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述包被抗原的最佳包被浓度为4μg/ml。
9.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述酶标酶标抗体工作液为HRP标记的羊抗猫二抗。