1.一种基于CRISPR/Cas系统的新型冠状病毒双靶标快速检测的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括:
两组RT‑RAA扩增引物:
Cas13‑S‑for:5’‑GAAATTAATACGACTCACTATAGGGgctatcatcttatgtccttccctcagtcag‑
3’;
Cas13‑S‑rev:5’‑aatggcaggagcagttgtgaagttcttttc‑3’;
Cas12‑N‑for:5’‑aatgtcgcgcattggcatggaagtcaca‑3’;
Cas12‑N‑rev:5’‑gacttgatctttgaaatttggatctttg‑3’;
两种CRISPR特异性检测的crRNA:Cas12a‑N‑crRNA:
5’‑uaauuucuacuaaguguagauauggcaccuguguaggucaa‑3’;
Cas13a‑S‑crRNA:
5’‑gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacCAUAAGUCACAUGCAAGAAGACUACACC‑3’;
RNA荧光探针:5’‑FAM‑mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA‑BHQ1‑3’;
其中,m代表2位氧甲基修饰,r代表核糖核苷酸;
DNA荧光探针:5’‑VIC‑TTATTATT‑BHQ1‑3’。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas系统的新型冠状病毒双靶标快速检测的试剂盒,其特征在于:还包括buffer A溶液和BufferB溶液;buffer A溶液配置方法为:向1L水中加入50mmol的Tris缓冲液,100nmol的醋酸钾,20g的聚乙二醇粉末和2mmol二硫苏糖醇;
BufferB溶液为浓度为280mM的醋酸镁溶液。
3.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas系统的新型冠状病毒双靶标快速检测的试剂盒,其特征在于:还包括:HEPES缓冲液、MgCl2溶液、10×NEB buffer2.1缓冲液、RNase inhibitor、T7 RNA polymerase、无RNA酶水。
4.一种基于CRISPR/Cas系统的新型冠状病毒双靶标快速检测方法,其特征在于:包括下列步骤:
步骤1:将待检测样本浸入病毒保存液中,然后用RNA提取试剂盒进行核酸提取,得到待检核酸;
步骤2:向一容纳有蛋白酶冻干粉的反应管中,加入37.5μL的buffer A溶液,2μL的Cas13‑S‑for,2μL的Cas13‑S‑rev,2μL的Cas12‑N‑for,2μL的Cas12‑N‑rev以及2μL待检核酸,然后加2.5μL的BufferB溶液,盖上反应管的管盖后进行扩增反应,得到核酸扩增产物;
Cas13‑S‑for:5’‑GAAATTAATACGACTCACTATAGGGgctatcatcttatgtccttccctcagtcag‑
3’;
Cas13‑S‑rev:5’‑aatggcaggagcagttgtgaagttcttttc‑3’;
Cas12‑N‑for:5’‑aatgtcgcgcattggcatggaagtcaca‑3’;
Cas12‑N‑rev:5’‑gacttgatctttgaaatttggatctttg‑3’;
步骤3:配置CRISPR反应混合液:将0.4μL的浓度为1M的HEPES缓冲液、0.18μL的浓度为
1M的MgCl2溶液、1.6μL的10×NEB buffer2.1缓冲液、0.8μL的浓度为25uM每个的rNTP mix、
2μL的浓度为的63.2ng/μL的LwaCas13a、1μL的浓度为10ng/μl的Cas13‑crRNA、1μL的浓度为
1uM的LbaCas12a、1μL的浓度为15ng/μl的Cas12‑crRNA,1μL的浓度为40U/μl的RNase inhibitor、0.1μL的浓度为50U/μl的T7 RNA polymerase、0.1μL的浓度为100uM的DNA荧光探针、0.1μL的浓度为100uM的RNA荧光探针和8.92μL的无RNA酶水混合;
Cas12a‑N‑crRNA:
5’‑uaauuucuacuaaguguagauauggcaccuguguaggucaa‑3’;
Cas13a‑S‑crRNA:
5’‑gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaacCAUAAGUCACAUGCAAGAAGACUACACC;
RNA荧光探针:
5’‑FAM‑mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA‑BHQ1‑3’;
其中,m代表2位氧甲基修饰,r代表核糖核苷酸;
DNA荧光探针:
5’‑VIC‑TTATTATT‑BHQ1‑3’;
步骤4:取2μL步骤2得到的核酸扩增产物加入到步骤3配置得到的CRISPR反应混合液,
37℃孵育30分钟;通过下列方法进行判断:
1、通过荧光定量PCR仪孵育并同时检测荧光,或直接水浴最后肉眼观察荧光变化;
2、在CRISPR反应孵育开始时使用qPCR仪器读取FAM通道下的荧光值,37℃孵育20个循环,每个循环间隔2分钟,每次循环结束记录一次荧光信号,通过最终荧光信号强度判断双靶点检测结果,即荧光值大于3000代表对应位点检测阳性,如FAM通道荧光值大于3000,即Cas13a所对应的新冠病毒S位点检测阳性,VIC通道荧光值大于3000,即Cas12a所对应的新冠病毒N位点检测阳性,荧光值小于2000代表对应位点检测阴性,若荧光值处于2000‑3000之间则重新检测一次,若荧光值依然为2000‑3000则判定对应位点检测阳性。
5.根据权利要求4所述的基于CRISPR/Cas系统的新型冠状病毒双靶标快速检测方法,其特征在于:buffer A溶液配置方法为:向1L水中加入50mmol的Tris缓冲液,100nmol的醋酸钾,20g的聚乙二醇粉末和2mmol二硫苏糖醇。