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专利号: 2021105795753
申请人: 大连工业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种魔芋人工种子的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:

(1)魔芋新球茎的诱导及增殖:

将魔芋分生区消毒杀菌后转接至芽分化培养基中,25~30℃黑暗条件下培养得魔芋新球茎,之后转接至培养基A增殖,25~30℃下黑暗培养;

所述芽分化培养基为在MS培养基中加入如下质量浓度的组分:6‑BA1.0~2.0mg/L、NAA0.1~0.5mg/L、蔗糖3%、琼脂0.4%;

所述培养基A为在芽分化培养基中加入0.05~0.2mg/L的KT;

(2)魔芋循环体细胞胚诱导:

(21)将所述魔芋新球茎转接至培养基B,在25℃、黑暗条件下诱导产生魔芋体细胞胚;

所述培养基B为在MS培养基中加入如下质量浓度的组分:IBA3.0~5.0mg/L、2,4‑D1.0~2.0mg/L、蔗糖3%、活性炭0.3%、琼脂0.4%;

(22)将所述魔芋体细胞胚转接至培养基C,在25℃、黑暗条件下诱导产生魔芋次级体细胞胚;

所述培养基C为在MS培养基中加入如下质量浓度的组分:IBA1.0~3.0mg/L、2,4‑D0.5~1.0mg/L、蔗糖3%、活性炭0.3%、琼脂0.4%;

(23)将所述魔芋次级体细胞胚转接至培养基D,在25℃、黑暗条件下诱导产生魔芋循环体细胞胚;

所述培养基D为在MS培养基中加入如下质量浓度的组分:IBA0.5~1.0mg/L、2,4‑D0.1~0.5mg/L、蔗糖3%、活性炭0.3%、琼脂0.4%;

(3)根癌农杆菌介导抗软腐病基因aiiA转化:

利用含有aiiA基因的根癌农杆菌EHA105的菌液将抗软腐病基因aiiA转化至魔芋循环体细胞胚,得抗性循环体细胞胚;

(4)将所述抗性循环体细胞胚制备成魔芋人工种子。

2.如权利要求1所述的一种魔芋人工种子的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述消毒杀菌的具体操作为:依次经自来水冲洗1h、无菌水浸泡30min、质量浓度75%酒精消毒

20s、NaClO溶液消毒15min、无菌水冲洗3遍。

3.如权利要求1所述的一种魔芋人工种子的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)的具体操作为:(31)将含有aiiA基因的根癌农杆菌EHA105在含有25~50mg/L卡那霉素和25~50mg/L利福平的YEB固体培养基平板划线,25℃倒置培养2~3d后转接至含有25mg/L卡那霉素的YEB液体培养基,25℃震荡暗培养至菌液OD600值为0.6~0.8;

(32)将所述菌液离心、弃上清、收集菌体,重悬液调节OD600值为0.4~0.6,得侵染液;

(33)将魔芋循环体细胞胚浸于侵染液15~20min,吸去表面多余侵染液,转接至共培养培养基;所述共培养培养基为在MS培养基中加入如下质量浓度的组分:IBA0.5~1.0mg/L、

2,4‑D0.1~0.5mg/L、蔗糖3%、乙酰丁香酮100μmol/L;

(34)将共培养后的循环体细胞胚用无菌水清洗一次、添加100~300mg/L的羧苄青霉素的无菌水清洗一次,吸干表面水分,转接至恢复培养基,所述恢复培养基为将共培养培养基中的乙酰丁香酮替换为100~200mg/L的羧苄青霉素,之后每2周重新转接一次,并逐步降低恢复培养基中羧苄青霉素的浓度至20~50mg/L,至魔芋循环体细胞胚恢复良好状态,得抗性循环体细胞胚。

4.如权利要求3所述的一种魔芋人工种子的制备方法,其特征在于,步骤(31)中所述YEB固体培养基成分为酵母提取物1g/L、牛肉浸膏5g/L、蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L、MgSO4·

7H2O4g/L、琼脂15g/L。

5.如权利要求3所述的一种魔芋人工种子的制备方法,其特征在于,步骤(32)中所述重悬液为在MS培养基中加入如下质量浓度的组分:IBA0.5~1.0mg/L、2,4‑D0.1~0.5mg/L、蔗糖3%。

6.如权利要求3所述的一种魔芋人工种子的制备方法,其特征在于,步骤(34)中所述良好状态为污染率达到10%以下且制备人工种子萌发率达85%以上。

7.如权利要求1所述的一种魔芋人工种子的制备方法,其特征在于,步骤(4)的具体操作为:将所述抗性循环体细胞胚先用质量浓度为3%的海藻酸钠溶液包埋,再滴入质量浓度为1%的CaCl2水溶液中,静置培养15~30min,得魔芋人工种子。