1.一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系,其特征在于所述检测体系包括用于检测恩诺沙星的免疫微球,该免疫微球的制备方法为:将油相金纳米颗粒与巯基化介孔二氧化硅球组装合成富金构建体,再进行羧基化修饰,然后偶联链霉亲和素和生物素化抗体,即制得免疫微球;其中,所述生物素化抗体即为生物素标记的恩诺沙星单克隆抗体;
所述免疫微球的具体制备步骤如下:
1)油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs的合成:
在氩气下将HAuCl4·4H2O加入甲苯中,并加入油胺,于90~105℃下回流搅拌反应5~7h;
反应结束后,加入乙醇,摇晃至有沉淀产生,离心弃去上清,所得沉淀均匀分散于氯仿中,即得到油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs分散液;
2)富金构建体的制备:
富金构建体的制备方法包括以下两步:
步骤A:向步骤1)所得油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs分散液中加入巯基化介孔二氧化硅球,超声均匀后,离心、风干,所得固体中加入辛基三甲氧基硅烷OTMS,超声均匀后转移至甲醇/氨水混合液中,继续超声反应20‑40分钟后离心得到复合物沉淀,复合物沉淀用甲醇洗涤除去多余的辛基三甲氧基硅烷OTMS后,加入至水中搅拌15 20h后,离心、分散于乙醇中,~形成中间产物分散液;
步骤B:向步骤A所得中间产物分散液中加入水、氨水、TEOS,室温搅拌反应,随后离心收集产物,洗涤,分散于乙醇中,即得到富金构建体分散液;
3)羧基化富金构建体的制备:
取步骤2)所得富金构建体分散液,搅拌下加入氨水,然后加入APTMS搅拌反应10‑15h,反应结束后将产物离心,用乙醇洗涤后,得到氨基修饰的富金构建体材料;然后将所述氨基修饰的富金构建体材料分散至N,N二甲基甲酰胺中,加入琥珀酸酐反应3 5h,反应结束后将~产物离心,依次用乙醇、水洗涤后,分散于水中,即得到羧基化富金构建体分散液;
4)免疫微球的制备
取步骤3)所得羧基化富金构建体分散液离心,水洗,然后加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐、N‑羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐和pH=6.0磷酸缓冲液,37℃活化20 40 ~min;随后离心收集产物,加入pH=7.4磷酸缓冲液和链霉亲和素,37℃摇床反应2 4h;反应结~束后,离心、洗涤,然后加入pH=7.4磷酸盐缓冲液和生物素化抗体,37℃摇床反应0.5 1.5h;
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反应结束后,离心,用pH=7.4磷酸缓冲液洗涤数次,即得所述免疫微球,将其分散于保存液中冷藏保存。
2.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系,其特征在于步骤1)中,HAuCl4·4H2O的质量与油胺的体积之比是1:10~15,质量的单位是g,体积的单位是mL。
3.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系,其特征在于步骤2)的步骤A中,油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs与巯基化介孔二氧化硅球的质量比是1 5:1。
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4.如权利要求3所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系,其特征在于步骤2)的步骤A中,油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs与巯基化介孔二氧化硅球的质量比是3:1。
5.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系,其特征在于步骤2)的步骤A中,甲醇/氨水混合液中氨水与甲醇的体积比为0.02 0.03:1;步骤2)、步骤3)中使~用的氨水浓度均是25 30%。
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6.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系,其特征在于步骤2)的步骤B中,水、氨水、TEOS三者的体积比是1:0.10 0.15:0.03 0.05;步骤2)的步骤A中油胺~ ~修饰的金纳米颗粒AuNPs的质量与步骤B中TEOS的体积之比是0.05 0.25:1,质量的单位是~mg,体积的单位是uL。
7.如权利要求6所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系,其特征在于步骤2)的步骤A中油胺修饰的金纳米颗粒AuNPs的质量与步骤B中TEOS的体积之比是0.15:1,质量的单位是mg,体积的单位是uL。
8.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系,其特征在于步骤4)中,羧基化富金构建体、链霉亲和素、生物素化抗体三者的质量之比是1:0.003 0.03:0.003~
0.03;步骤4)中,所述生物素化抗体即为生物素标记的恩诺沙星单克隆抗体。
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9.如权利要求8所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系,其特征在于步骤4)中,羧基化富金构建体、链霉亲和素、生物素化抗体三者的质量之比是1:0.006 0.0065:~
0.006 0.0065。
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10.如权利要求1所述的一种用于检测皮克级恩诺沙星的检测体系,其特征在于所述检测体系还包括用于检测恩诺沙星的试纸条,该试纸条包括NC膜、样品垫和吸水纸;所述样品垫、NC膜和吸水纸搭接组装,样品垫和吸水纸分别叠压在NC膜的两端,并在NC膜的表面形成检测区;所述检测区的NC膜上设置靠近样品垫的检测线区T线、靠近吸水纸的一条控制线区C线;其中,在试纸条的T线上为包被抗原,在试纸条的C线上为羊抗鼠二抗。
11.一种皮克级恩诺沙星的检测方法,采用根据权利要求1~10中任一项所述的检测体系,其特征在于该方法的具体步骤为:M1:首先制备试纸条,试纸条包括NC膜、样品垫和吸水纸;所述样品垫、NC膜和吸水纸搭接组装,样品垫和吸水纸分别叠压在NC膜的两端,并在NC膜的表面形成检测区;所述检测区的NC膜上设置靠近样品垫的检测线区T线、靠近吸水纸的一条控制线区C线;其中,在试纸条的T线上为包被抗原,在试纸条的C线上为羊抗鼠二抗;
M2:配制一系列不同浓度的恩诺沙星溶液,将含免疫微球的分散液加入96孔板中,然后加入不同浓度的恩诺沙星溶液孵育3 10min,将步骤M1制备好的试纸条插入孵育液中层析3~
10min,对试纸条的NC膜用金标读数仪进行检测分析,获得NC膜的T线及C线区域的金标读~数仪测量的吸收峰信号谱图,当恩诺沙星浓度大于0ng/mL时信号谱图中T线区的峰面积与C线区的峰面积的比值为B,当恩诺沙星浓度等于0ng/mL时信号谱图中T线区峰面积与C线区峰面积为B0,B0为常数,以B/B0为纵坐标,并以恩诺沙星溶液浓度的Lg值为横坐标,进行绘制标准曲线,获得相应的线性回归方程;
M3:将含免疫微球的分散液加入96孔板中,然后加入待测样本孵育3 10min,将步骤M1~制备好的试纸条插入孵育液中层析3 10min,对试纸条的NC膜用金标读数仪进行检测分析,~获得NC膜的T线及C线区域的金标读数仪测量的吸收峰信号谱图,计算信号谱图中T线区的峰面积与C线区的峰面积的比值B1,并代入步骤M2的线性回归方程,即可计算得到待测样本中的恩诺沙星含量。