1.一种醛酮还原酶KmAKR突变体,其特征在于所述的醛酮还原酶KmAKR突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列突变为下列之一:(1)第213位谷氨酰胺突变为丙氨酸,且第23位苏氨酸突变为缬氨酸;(2)第30位丙氨酸突变为脯氨酸,第302位苏氨酸变为丝氨酸,第109位天冬氨酸突变为赖氨酸,第196位丝氨酸突变为半胱氨酸。
2.一种权利要求1所述醛酮还原酶KmAKR突变体编码基因构建的重组基因工程菌。
3.一种权利要求1所述醛酮还原酶KmAKR突变体在不对称还原羰基化合物制备手性醇中的应用,其特征在于,所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第213位谷氨酰胺突变为丙氨酸,且第23位苏氨酸突变为缬氨酸时,所述羰基化合物为下列之一:6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯、6‑氯‑(5S)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯、4‑氯‑3‑羰基丁酸乙酯、3‑羰基乙酸乙酯、4,4,4,‑三氟‑3‑羰基丁酸乙酯、3‑羰基丁酸叔丁酯、4‑氧代戊酸乙酯、3‑氧代己酸乙酯、4‑甲基‑3‑氧代戊酸甲酯、4‑氯‑3‑羰基丁酸甲酯、4‑甲基‑3‑氧代戊酸乙酯、苯乙酮、4‑乙基苯乙酮、4‑甲氧基苯乙酮、3,4‑二甲氧基苯乙酮、4‑苯基‑2‑丁酮、苯丁酮;所述突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第30位丙氨酸突变为脯氨酸,第302位苏氨酸变为丝氨酸,第109位天冬氨酸突变为赖氨酸,第196位丝氨酸突变为半胱氨酸时,所述羰基化合物为下列之一:6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯、6‑氯‑(5S)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯、4‑氯‑3‑羰基丁酸乙酯、3‑羰基乙酸乙酯、4,4,4,‑三氟‑3‑羰基丁酸乙酯、3‑羰基丁酸叔丁酯、4‑氯‑3‑羰基丁酸甲酯。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于所述应用的方法为:将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体和含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体混合,以混合菌体为催化剂,以羰基化合物为底物,以葡萄糖为辅底物,以pH o
7.0、100 mM的磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系,在30~40 C、600~800 rpm条件下进行反应,反应结束,反应液经分离纯化获得手性醇化合物。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述转化体系中,底物加入终浓度30~450 g/L,葡萄糖加入终浓度30~450 g/L,催化剂用量以混合菌体总量干重计为0.1~20 g DCW/L,所述混合菌体中含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体与含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体以干重比1.0~5.0 : 1.0 混合。
6.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述湿菌体按如下方法制备:将含醛酮还原酶o
KmAKR突变体基因的工程菌接种到含终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中,37 C培养10 h,获得种子液;将种子液以体积浓度1.0%的接种量接种到新鲜的含终浓度50 μg/mLo卡那霉素的LB液体培养基中,37 C、180 rpm培养至OD600=0.6~0.8,培养液中加入终浓度o o
为0.15 mM异丙基硫代半乳糖苷,28 C培养12 h后,4 C、8000 rpm离心10 min,获得含醛酮还原酶突变体的湿菌体;所述含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体制备方法同含醛酮还原酶突变体基因的湿菌体。
7.如权利要求4所述的应用,其特征在于所述催化剂为含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经诱导培养获得的湿菌体提取的纯酶,以羰基化合物为底物,以NADPH为辅酶,以opH 7.0、100 mM的磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系,在30~40 C、600~800 rpm条件下进行反应,反应结束,反应液分离纯化,获得手性醇化合物;所述转化体系中底物加入终浓度为0.5~2.0 mM,辅酶加入终浓度为0.5~2.0 mM,所述催化剂加入量为5925 ‑37290 U/L。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于所述纯酶按如下方法制备:将含醛酮还原酶KmAKR突变体基因的工程菌经发酵培养的湿菌体以50 g/L的量重悬于pH 7.0、100 mM PBS缓冲液中,在冰水混合物上超声破碎10 min,超声破碎条件:功率为400 W,破碎1 s、暂停1 os,取破碎混合液,获得粗酶液;粗酶液8000 rpm,4 C下离心10 min,收集上清液,通过0.45 μm膜微过滤后,采用镍亲和柱纯化突变体蛋白,纯化操作如下:①用含300 mM NaCl、20 mM咪唑的pH 7.0、20 mM PBS进行预平衡;②以1.0 mL/min的流速上样,用含300 mM NaCl、20 mM咪唑的pH 7.0、20 mM PBS以1.0 mL/min的流速洗去未结合的杂质,直至电导率稳定;③然后用含0.3 M NaCl、500 mM咪唑的pH 7.0、20 mM PBS洗脱目的蛋白;将收集的洗脱液用
20 mM pH 7.0 PBS透析过夜,取截留液,即为突变体的纯酶。