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专利号: 2021100669311
申请人: 陕西科技大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-04-09
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种包含蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体的原核表达系统载体,其特征在于,所述蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6或SEQ ID NO7。

2.如权利要求1所述的载体,其特征在于,优选蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体氨基酸序列为:SEQ ID NO7。

3.如权利要求1所述的载体,其特征在于,所述蜡样芽孢杆菌胶原酶突变体包含X‑Y个突变;其中SEQ ID NO1含8个氨基酸序列突变,SEQ ID NO2含10个氨基酸序列突变,SEQ ID NO3含12个氨基酸序列突变,SEQ ID NO4含15个氨基酸序列突变,SEQ ID NO5含23个氨基酸序列突变,SEQ ID NO6含31个氨基酸序列突变,SEQ ID NO7含39个氨基酸序列突变。

4.如权利要求1所述的载体,其特征在于,所述原核表达系统为大肠杆菌,表达载体为pET系列载体。

5.如权利要求4所述的载体,其特征在于,表达载体为pET21a载体。

6.权利要求1‑5任一项所述的载体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:通过PCR扩增技术合成氨基酸序列为SEQ ID NO7的蜡样芽孢杆菌胶原酶基因,将前述基因与pET‑21a载体组建成为质粒。

7.一种改进的耐热蜡样芽孢杆菌胶原酶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:利用热激法将权利要求1‑5任一项所述的载体转化到大肠杆菌感受态细胞中,利用氨苄青霉素对菌落进行筛选,通过摇床悬浮培养,在菌体OD600值达到0.6‑0.8时加入IPTG诱导剂诱导其表达;离心收集菌体沉淀并破碎,再次离心收集上清液;将破碎过滤后的菌液上清液经蛋白纯化柱洗脱纯化,得到改进的耐热蜡样芽孢杆菌胶原酶。

8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:

1)将权利要求1‑5任一项所述的载体转化到大肠杆菌BL21(DE)3中,利用氨苄青霉素对菌落进行筛选,通过摇床悬浮培养,在菌体OD600值达到0.6‑0.8时加入IPTG诱导剂诱导其表达;

2)收集菌体沉淀并破碎得到上清液;

3)用超纯水清洗蛋白纯化镍柱,再将5倍柱体积的缓冲液1清洗纯化柱,随后将破碎离心后的菌液上样到蛋白纯化镍柱;上样结束后,用5倍柱体积的缓冲液2、缓冲液3先后洗涤蛋白纯化柱,最后用缓冲液4洗涤并收集洗脱下来的蛋白液;其中缓冲液1的组成为0.02 M咪唑含0.1 M NaCl、0.02 M Tris‑HCl pH=8;缓冲液2的组成为0.05 M咪唑含0.1 MNaCl、

0.02 M Tris‑HCl pH=8;缓冲液3的组成为0.1 M咪唑含0.1 MNaCl、0.02 M Tris‑HCl pH=

8;缓冲液4的组成为0.5 M咪唑含0.1 MNaCl、0.02 M Tris‑HCl pH=8。

9.权利要求7或8所述方法制备的耐热蜡样芽孢杆菌胶原酶。