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专利号: 2020113038430
申请人: 江苏海洋大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
专利领域: 生物化学;啤酒;烈性酒;果汁酒;醋;微生物学;酶学;突变或遗传工程
更新日期:2024-10-29
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)SYM-1,其特征在于:其保藏号为CCTCC NO: M 2020756。

2.权利要求1所述的胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)SYM-1的筛选方法,其特征在于,其步骤如下:(1)酵母菌的分离纯化

采集样品,分别取5 mL样品于45 mLYEPD液体培养基中,28℃,180 r/min富集培养48 h,液体混浊后,进行梯度稀释,分别取10-4、10-5、10-6、10-7 4个稀释浓度100 µL涂布在直径

9cm的YEPD平板上, 28℃恒温培养48 h,根据菌落形态特征,挑取酵母菌菌落在PDA培养基上三区划线进行分离纯化至单菌落,将分离到的19株酵母菌株接种在PDA斜面上保存;

(2)酵母菌无菌发酵液的制备

将酵母菌菌株在PDA斜面上活化48 h,接种两环斜面种子培养基上培养的酵母菌于盛有50 mL液体YEPD培养基的250 mL三角瓶中,180 r/min振荡培养24 h,作为种子液;将种子液按10%的接种量接种到盛有60 mL的YEPD液体培养基的三角瓶内,28℃、180 r/min振荡培养3d,发酵液于4 ℃、5000 r/min离心20 min,上清液过0.22 μm细菌过滤器即为无菌发酵液;

(3)抑菌作用测定

采用牛津杯法测定抑菌圈直径;分离得到的19个酵母菌株中,HS-1、HN-1、SYM-1、HS-2、BCH-1对创伤弧菌有抑制作用;抑菌带宽度为4.3 mm;RDN-1、HN-1、SYM-1、SYM-2、HS-2、BCH-

1对副溶血弧菌有抑制作用,其中HS-2菌株和SYM-1菌株的抑菌带宽度分别为7.2 mm和6.5 mm;HN-1、SYM-1、HS-2、BCH-1对鳗弧菌有抑制作用;

选择抑制作用较强的7株海洋酵母菌的无菌发酵液,测定无菌发酵液对创伤弧菌、鳗弧菌和副溶血弧菌的抑制作用,SYM-1、HN-1、HS-2、BCH-1 4个菌株的发酵液对3种弧菌均具有明显的抑制作用,SYM-1对三种弧菌的抑菌带宽度均达到2.5mm以上;

(4)氨氮降解率的测定

将筛选出的抑制弧菌作用较强的酵母菌菌株在PDA斜面上活化培养2-3 d,用氨氮降解培养基洗下菌苔,制备成5×108 CFU/mL菌悬液,按10%的接种量接入到装有60 mL氨氮降解培养基的250 mL三角瓶中,每个菌株接种3瓶,为3次重复,于28℃、180 r/min条件下振荡培养48 h;发酵液于4℃、5000 r/min条件下离心20 min,取上清液,采用靛酚蓝分光光度法测定不同菌株上清液的OD637,根据标准曲线计算发酵液中的氨氮浓度,以未接种的培养基作为对照,计算不同菌株的氨氮降解率;筛选得到在氨氮浓度50mg/L时降解率达96.85%菌株SYM-1;

(5)降解亚硝态氮作用测定

将筛选出的抑制弧菌作用较强的酵母菌菌株在PDA斜面上活化培养2-3 d,用亚硝酸盐降解培养基洗下菌苔,制备成5×108CFU/mL菌悬液,按10%的接种量接入装有60 mL液体亚硝酸盐降解培养基的250 mL三角瓶中,每个菌株接种3瓶,为3次重复, 28℃、180 r/min条件下振荡培养48 h;发酵液于4℃、5000 r/min条件下离心20 min,取样品上清液100 μL,加入6 mL的Griess试剂,室温下反应20 min,测538 nm的吸光值;根据标准曲线计算不同菌株发酵液中的亚硝态氮浓度,以未接种的培养基作为对照,计算不同菌株的亚硝态氮降解率;

筛选得到在亚硝态氮浓度为50mg/L时,降解率为64.66%的菌株SYM-1;

(6)菌株的种类鉴定

选择降解亚硝态氮和氨氮降解率高和具有抑菌作用的酵母菌株SYM-1进行种类鉴定;

将SYM-1的18S rRNA基因序列与NCBI中的序列进行比对,SYM-1菌株的18S rRNA与胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)的相似性为100.0%;确认SYM-1菌株为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)。

3.权利要求1所述的胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)SYM-1的用途,其特征在于,所述的用途为将胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)SYM-1菌株或其发酵液用作抑制弧菌的抑菌剂。

4.根据权利要求3所述的胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)SYM-1的用途,其特征在于:所抑制的弧菌为创伤弧菌、副溶血弧菌或者鳗弧菌。

5.权利要求1所述的胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)SYM-1的用途,其特征在于,所述的用途为将胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)SYM-1菌株或其发酵液用作降解氨氮和亚硝态氮作用菌剂。

6.根据权利要求5所述的胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)SYM-1的用途,其特征在于,所述的用途为将胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)SYM-1菌株或其发酵液用在水产养殖病害的生物防治或养殖水污染治理过程中。