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专利号: 2020109930552
申请人: 湖州眺旺生物科技有限公司
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

1)构建含白额高脚蛛毒素多肽编码基因的重组表达载体,所述重组表达载体pVT102U/α含如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的任一核苷酸序列;

2)所述重组菌为含重组表达载体pVT102U/α的酿酒酵母,将步骤1)得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌;

3)重组菌在YSD液体培养基中发酵培养,表达获得白额高脚蛛毒素多肽,所述重组白额高脚蛛毒素多肽为U1、U3、U4或U27中的任意一种,U1、U3、U4、U27的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。

2.如权利要求1所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法,其特征在于,所述重组表达载体pVT102U/α为pVT102U/α‑U1、pVT102U/α‑U3、pVT102U/α‑U4或pVT102U/α‑U27。

3.如权利要求2所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法,其特征在于,所述步骤1)中构建重组表达载体的具体操作,包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体。

4.如权利要求1所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法,其特征在于,所述步骤2)中构建重组菌的具体操作为:取pVT102U/α‑U1、pVT102U/α‑U3、pVT102U/α‑U4和pVT102U/α‑U27中的任一重组表达载体,热击转化酿酒酵母,采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选,其操作为:将重组表达载体质粒DNA1.0μg;carrier DNA,10μg;酿酒酵母菌悬液,20μL;PEG溶液(10×TE,1M LiAC,50%PEG 4000,以1:1:8的体积比混合)1.5mL加入10mL无菌管中,混合,30℃,200rpm,培养30min;42℃热击15min后,5000g,离心5min;弃上清,细胞沉淀用200μL 1×TE洗涤,5000g,离心5min;弃上清,细胞沉淀悬浮于200μL 1×TE溶液中;细胞悬浮液涂YSD板,30℃培养4‑6天。

5.如权利要求1所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法,其特征在于,所述步骤3)中重组菌发酵培养表达的具体操作为:挑取2~4个3~5mm的重组菌于3mL YSD液体培养基中,

28~32℃,220~280rpm,培养12~16h;按1:20~50的比例将制备的种子液接种入50mL YSD液体培养基中,28~32℃,220~280rpm,培养12~16h;再按1:20~50的比例将制备的种子液接种入1.0L YSD液体培养基中,28~32℃,220~280rpm,培养60~72h。

6.如权利要求1~5任一项所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法,其特征在于,所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法还包括:

4)蛋白纯化:收集步骤3)发酵培养得到的发酵产物的上清,分离纯化。

7.如权利要求6所述重组白额高脚蛛毒素多肽的制备方法,其特征在于,所述蛋白纯化的具体操作为:将发酵产物的上清和预先用0.05M Tris·HCl(pH7.5)缓冲液混合,室温放置0.5~1h,然后用抽滤瓶抽滤,所得到的滤液,pH值调至7.5后,直接上预先用0.05M Tris·HCl(pH7.5)平衡好的DEAE阴离子交换柱,然后分别用含0.1M,0.3M,0.5M,1.0M NaCl的0.1M NaCl缓冲液进行洗脱,收集每个洗脱峰进一步采用RP‑HPLC纯化,低温冻干。