1.一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法,包括第一次三元溶液处理、第二次三元溶液处理、DnaseⅠ酶处理和第三次三元溶液处理四个步骤,其特征在于:所述三元溶液由无水氯化钙、去离子水、无水酒精的摩尔比为1:7~9:1~3配制而成;所述第一次三元溶液处理为将猪皮用三元溶液浸没,于70~80℃反应0.5~1.5h,然后将猪皮取出,放入去离子水中浸泡,待观察到皮片出现从上往下依次为表皮层、真皮层和皮下组织层的分层现象时,用取皮机切取猪真皮层;所述第二次三元溶液处理为将猪真皮层放入抽滤瓶中,加入三元溶液浸没,抽滤;取出皮片,置于广口瓶中,加入三元溶液浸没,于70~80℃反应1~10h,然后将皮片取出放入去离子水中浸泡清洗至无丝滑感;所述DnaseⅠ酶处理为将无丝滑感的皮片与DnaseⅠ酶在密闭环境中以36~38℃条件下按照120~180r/m的转速反应80~
100min,然后用磷酸盐缓冲液漂洗去除细胞残留物;所述第三次三元溶液处理为将经过DnaseⅠ酶处理后的皮片用三元溶液浸没,于70~80℃反应1~2h,然后将皮片取出,用去离子水冲洗,即得。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述三元溶液由无水氯化钙、去离子水、无水酒精的摩尔比为1:8:2配制而成。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述猪真皮层的厚度为1.4mm-1.8mm。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于:所述猪真皮层的厚度为1.6mm。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于:所述第一次三元溶液处理的反应温度为75℃;所述第二次三元溶液处理的反应温度为75℃;所述第三次三元溶液处理的反应温度为
75℃。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法,其特征在于:所述第二次三元溶液的处理时间为
4~6h。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于:所述第二次三元溶液的处理时间为5h。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于:所述DnaseⅠ酶处理步骤中酶浓度为40U/ml,反应温度为37℃,转速为150r/m,反应时间为90~100min。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于:所述第三次三元溶液处理的时间为90min。
10.一种猪脱细胞真皮基质皮肤替代物的制备方法,采用如下步骤:
(1)第一次三元溶液处理:将新鲜的猪皮切为7cm×7cm,置于广口瓶中,以固液比1:4加入三元溶液浸没后,置于75℃的水浴锅中反应1h,处理完成后将皮片取出,放入去离子水中浸泡清洗、冷却3h,每1h更换一次去离子水。待观察到皮片出现明显的分层现象时(从上往下依次为表皮层、真皮层和皮下组织层),用取皮机切取约1.6mm厚的真皮层。
(2)第二次三元溶液处理:将猪真皮层放入抽滤瓶中,再加入适量三元溶液至浸没,抽滤3次,取出皮片,置于250mL的广口瓶中,再以固液比1:10加入三元溶液至浸没后,置于75℃的水浴锅中反应5h。处理完成后将皮片取出放入去离子水中浸泡清洗至无丝滑感,每1h更换一次去离子水,除去多余的钙离子。
(3)DnaseⅠ酶处理:将皮片放入烧杯中,加入适量DnaseⅠ酶溶液(含40U/ml DNaseⅠ酶,
10mmol/L氯化镁的磷酸盐缓冲液溶液)后,用保鲜膜封口,放入37℃水浴锅中以150r/m的转速反应90min随后用磷酸盐缓冲液漂洗6次,每次15分钟,进一步去除细胞残留物;
(4)第三次三元溶液处理:将经过酶处理后的皮片置于广口瓶中,再以固液比1:10加入三元溶液至浸没后,置于75℃的水浴锅中反应90min,处理完成后将皮片取出,用去离子水中反复冲洗至无丝滑感,获得透明的猪脱细胞真皮基质。