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专利号: 2020106680428
申请人: 新乡医学院
专利类型:发明专利
专利状态:无效专利
更新日期:2024-12-10
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

2.含有如权利要求1所述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇的重组表达载体。

3.构建权利要求2所述的重组表达载体的方法,其特征在于,是将权利要求1所述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇连接于载体上。

4.含有如权利要求1所述经过遗传改造的紫色杆菌素生物合成基因簇或如权利要求2所述的重组表达载体的基因工程菌。

5.构建如权利要求4所述的基因工程菌的方法,其特征在于,是将权利要求2所述的重组表达载体导入宿主菌,获得高产紫色杆菌素基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的构建基因工程菌的方法,其特征在于,所述宿主菌为E.coli ‑BL21(DE3) (tnaA),是将序列如SEQ ID NO:6所示的E.coli BL21(DE3)基因组中的tnaA基因由序列如SEQ ID NO:7所示的卡那霉素抗性基因替换。

7.一种生产紫色杆菌素的方法,是将权利要求4所述的基因工程菌接种到含有碳源的培养基中发酵生产紫色杆菌素。

8.根据权利要求7所述的生产紫色杆菌素的方法,其特征在于,所述培养基为LB液体培养基:1%蛋白胨,0.5%酵母粉,0.5%氯化钠;或LB固体培养基:1%蛋白胨,0.5%酵母粉,0.5%氯化钠,3%琼脂粉。

9.根据权利要求7所述的生产紫色杆菌素的方法,其特征在于,发酵温度为25℃‑37℃;

发酵时间为24‑72小时。

10.根据权利要求7所述的生产紫色杆菌素的方法,其特征在于:培养基中还添加诱导剂IPTG,其浓度为0.01‑0.04mM。

11.根据权利要求7所述的生产紫色杆菌素的方法,其特征在于:培养基中还添加色氨酸前体,其浓度为1‑2mM。

12.根据权利要求7所述的生产紫色杆菌素的方法,其特征在于:发酵温度为30℃,发酵时间为48h,培养基中还添加诱导剂IPTG和色氨酸前体,培养基中添加诱导剂IPTG的浓度为

0.02mM,饲喂色氨酸前体的浓度为2mM。

13.一种分离纯化紫色杆菌素的方法,是将根据权利要求7‑9任一项所述的生产紫色杆菌素的方法得到的发酵液收集,12000rpm离心5min,舍弃上清液得到细胞沉淀,用一倍体积甲醇洗涤3次,直到细胞沉淀无色为止;再将洗涤后的甲醇进行真空蒸馏富集,得到紫色杆菌素粗品。

14.根据权利要求13所述的分离纯化紫色杆菌素的方法,其特征在于:所述方法还包括用硅胶柱层析法对所得的紫色杆菌素粗品进一步纯化的步骤:将0.2 g紫色杆菌素粗品溶解于1ml甲醇,加入到2 cm×20 cm硅胶柱上,利用500 ml乙酸乙酯/石油醚=9/1进行洗脱,分步收集洗脱液,真空干燥后得到紫色杆菌素。

15.根据权利要求14所述的分离纯化紫色杆菌素的方法,其特征在于:所述方法还包括高效液相色谱分离的步骤,条件为:色谱柱:YMC‑Pack ODS‑AQ,4.6×250mm,5μm;流动相A:ddH2O;流动相 B:乙腈,含0.5%甲酸;检测波长:UV=575nm;柱温:30℃;流速:1.0mL/min;洗脱程序0‑15min,50%‑100%B;15‑16min,100% B;16‑17min,100% ‑50%B;17‑30min,50% B;收集保留时间为7min的洗脱峰,真空干燥,得到99.9%纯度的紫色杆菌素纯品;收集保留时间为10.5min的洗脱峰,真空干燥,得到99.9%纯度的脱氧紫色杆菌素纯品。