1.一种在3D多孔聚乳酸生物材料中培养小肠类器官的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)在150‑180 ℃温度下,将融化蔗糖加入至二甲基硅油中,以300‑500 rpm均匀搅拌
20‑30 min,再倒入冷冻二甲基硅油,并将混合物于冰水混合物中充分冷却,后在正己烷中经筛网分选出糖球作为致孔剂;经筛网分选出的糖球的粒径尺寸为300‑1300µm; 所述步骤(1)中,以质量百分比5‑50%的比例将融化蔗糖加入二甲基硅油中进行乳化;步骤(1)中冷冻二甲基硅油与乳化二甲基硅油的体积比为0.5‑5;
(2)将糖球填充于聚四氟乙烯模具凹槽中,于50‑70 ℃下加热5‑60 min以获得致孔剂模板;
(3)将聚乳酸溶解于1,4‑二氧六环中,溶解完全后将其倒入致孔模板中,在真空干燥器中保持抽真空15‑30 min后冷冻干燥,待干燥完全后,利用超纯水溶解致孔剂获得多孔聚乳酸支架;聚乳酸与1,4‑二氧六环的质量比例为1‑10%;
(4)取小肠组织用磷酸缓冲液清洗后剪碎,经乙二胺四乙酸消化分离出隐窝,清洗后离心,去除上清后加入适量基质胶并混匀,步骤(4)中控制每40 µL基质胶含100‑300个类器官,置于细胞培养板中,待基质胶凝固后添加小肠类器官完全培养基并培养3‑5天;
其中,所述的步骤(4)中的取小鼠小肠组织用磷酸缓冲液清洗,具体为:使用盖玻片刮去小肠组织内粪便、黏膜、绒毛,随后在预冷的PBS中反复吹打20‑30次,以清洁小肠组织;
所述的小肠类器官完全培养基为在DMEM/F12培养基中,加入如下体积百分比或浓度的各组分:1% 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、1% L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺二肽、100 µg/mL 青霉素、100 µg/mL链霉素、20% R‑spondin条件培养基、10% Noggin条件培养基、0.05 µg/mL 表皮生长因子、500 nM N‑乙酰半胱氨酸、1% 神经元细胞培养补充剂N2和2% B27;
(5)使用移液枪吸去步骤(4)中的小肠类器官完全培养基,加入预冷的磷酸缓冲液吹打收集类器官悬液,吹打并清洗;
(6)将上述类器官悬液离心后,向其中加入混合液并使其混合均匀;步骤(6)中的混合液由小肠类器官完全培养基与基质胶均匀混合而得,其中小肠类器官完全培养基所占体积比例为0‑30%;将混合液与类器官充分混合后通过一次性医用注射器接种于多孔聚乳酸支架中,20‑30 min后待基质胶凝固后加入小肠类器官完全培养基并完全浸没多孔聚乳酸支架,置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养;(7)使用注射器将步骤(6)中所得悬液接种于多孔聚乳酸支架内,凝固后加入小肠类器官完全培养基培养。
2.根据权利要求1所述的3D多孔聚乳酸基质中培养小肠类器官的方法,其特征在于所述的步骤(4)中也可以选用冻存的小肠类器官,将其复苏后,添加小肠类器官完全培养基于细胞培养板中培养3‑5天。