1.一种猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法,其特征在于,包括以下步骤:步骤一、提取病毒RNA:取适量猪流行性腹泻病毒阳性病料,加入5倍体积的无菌PBS,匀浆后于‑20℃保存;反复冻融3次,采用Trizol试剂法提取病毒RNA;
步骤二、cDNA 合成:采用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)试剂盒对提取的病毒RNA进行反转录,获得cDNA;
步骤三、PCR扩增:设计上游引物SA1,其序列如SEQ ID NO:1所示或如SEQ ID NO:2所示;设计下游引物SA2, 其序列如SEQ ID NO:3所示,使用上游引物SA1及下游引物SA2,对cDNA进行PCR扩增,得到含有S全基因片段的PCR扩增产物;
步骤四、基因片段检测及测序:将所述PCR扩增产物经核酸凝胶电泳进行检测;将目的片段纯化后,进行测序。
2.如权利要求1所述的S基因全序列扩增方法,其特征在于,所述步骤一中,所述Trizol试剂法的具体方法为:a、取1ml组织悬液,于4℃,经5000rpm离心10min,获得第一上清液;b、取300μL第一上清液于无RNA酶的灭菌1.5ml EP管中,加入500μL Trizol,充分混匀,室温静置10min;c、加入500μL三氯甲烷,充分混匀,室温静置10min,于4℃ ,经12000rpm 离心
10min,获得第二上清液;d、取500μL第二上清液至新的1.5mL EP管中,加入1.0ml 异丙醇,充分混匀,‑20℃静置20min,于4℃,经12000rpm 离心10min;e、弃掉上清,倒置于吸水纸上,室温自然风干;f、加入20μL 无RNase ddH2O,溶解沉淀,即为病毒RNA,将样品保存于‑70℃。
3.如权利要求1所述的S基因全序列扩增方法,其特征在于,所述步骤三中,所述PCR扩增反应体系为:
2×Taq Plus Master Mix 12.5μL
上游引物SA1 1μL
下游引物SA2 1μL
cDNA 1μL
ddH2O 9.5 μL;
上游引物SA1的浓度为10pmol/μL,下游引物SA2的浓度为10pmol/μL;
所述PCR扩增反应程序为94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸5min,设置30个循环;72℃终延伸10min。
4.如权利要求1所述的S基因全序列扩增方法,其特征在于,所述步骤四中,所述目的片段采用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit试剂盒进行纯化。
5.一种如权利要求1所述猪流行性腹泻病毒S基因全序列扩增方法的应用,其特征在于,用于对猪流行性腹泻病毒S基因全序列的检测与分析,该应用为非诊断目的。
6.如权利要求5的应用,其特征在于,将扩增方法获得的产物,测序后,进行同源性比对,对所扩增的猪流行性腹泻病毒进行分类。
7.如权利要求6的应用,其特征在于,所述同源性比对为将测序获得的序列与NCBI上已知的猪流行腹泻病毒S基因进行比对。