1.一种温郁金毛状根的诱导方法,其特征在于包括以下步骤:
1)侵染液的制备
分别取‑80℃保存的野生型的发根农杆菌K599及‑80℃保存的温郁金内生菌WYJ‑E13,经活化与培养后分别制得发根农杆菌侵染液和内生菌侵染液,待用;
2)活体组培苗的培养
于200mL的培养瓶中,加入MS(0)固体培养基50mL,在培养基中接入高1‑2cm的组培苗,在培养瓶中接入组培苗后,随即用加样枪吸取5‑10μL的内生菌侵染液,加到组培苗基部的培养基表面;
3)毛状根的诱导
经步骤2)处理的组培苗与内生菌侵染液共培养15天,然后用无菌剪刀在距离组培苗根部0.5‑1cm的茎处,剪除组培苗上部,仅留组培苗0.5‑1cm的茎和根,用微量加样枪吸收发根农杆菌侵染液2‑5μL直接滴加到组培苗茎的剪切口处,随后将侵染后的组培苗于28℃的温度条件下遮光培养15‑30天,在组培苗的剪切口上部得到毛状根;
4)毛状根的脱菌培养及繁殖
待诱导出的毛状根长至3cm以上时,剪下毛状根并接种到含500 mg/LCef的MS培养基上,每20 d继代1次,经过3次继代完全灭杀农杆菌后,转入MS培养基培育繁殖毛状根;
其中,发根农杆菌侵染液的制备,具体为将‑80℃保存的野生型的发根农杆菌K599在含有50 mg/L Str的LB培养基上划线培养;取培养后的单菌落于含有50 mg/L Str的LB液体培养基中过夜培养,当农杆菌生长到菌液OD值约为1.0时,取1 mL菌液于1.5 mL离心管中,离心、除上清;用MS液体培养基悬浮菌体,离心、除上清;再用MS液体培养基稀释至OD值约为
0.1,用作农杆菌侵染液;
内生菌侵染液的制备,具体为将‑80℃保存的温郁金内生菌WYJ‑E13在含有 50 mg/L Str的PDA培养基上划线培养,取培养后的单菌落于含有50 mg/L Str的PDA液体培养基中过夜培养,当内生菌的菌液OD值约为1.0时,取1 mL菌液于1.5 mL离心管中,离心、除上清;用MS液体培养基悬浮菌体,离心、除上清;再用MS液体培养基稀释至OD值约为0.01,用作内生菌侵染液。
2.如权利要求1所述的一种温郁金毛状根的诱导方法,其特征在于各培养均于28℃的温度条件下进行,且200 r/min的条件下摇床培养。