1.一种温山药转基因毛状根的诱导方法,其特征在于包括以下步骤:
1)外植体的消毒
取外植体进行清洗、消毒,再将叶片剪成1cm见方小块,带或不带叶腋的茎段均剪成长
0.5-1cm;
2)外植体的培养
取步骤1)得到的外植体接种于诱导培养基上,每瓶接种3-5个,遮光培养15-25天,获得愈伤组织;取愈伤组织剔除愈伤四周褐化的部分,转入分化培养基上,光照培养20-30天,获得丛生芽;取丛生芽切割后的单个芽转入生根培养基上,光照培养15-20天,获得完整植株;
所述诱导培养基为含2.0mg/L的2,4-D的MS培养基,所述分化培养基为含6-BA 2mg/L+IAA
0.5mg/L的MS培养基,所述生根培养基为含1.0mg/L IAA的MS培养基;诱导培养、分化培养和生根培养的培养温度均为24±2℃;
3)侵染液的制备
取重组型发根农杆菌K599经活化和培养后得到侵染液;
4)毛状根的诱导和繁殖
取转接后12-15d、生长旺盛组培苗,用灭菌的解剖针在组培苗茎上刺出多个伤口,将2-
10μL侵染液滴加到伤口处,随后将侵染后的组培苗继续在24±2℃、遮光培养15-30天,得到毛状根;
5)毛状根的繁殖
待毛状根长2-3cm后,剪下毛状根并转入含500mg/L Cef+50mg/L Km的MS培养基上,每
20-30d继代1次,经过3-4次继代完全杀灭农杆菌后,转入MS基本培养基繁殖毛状根。
2.如权利要求1所述的一种温山药转基因毛状根的诱导方法,其特征在于所述的步骤
1)中外植体清洗、消毒具体为:外植体先用稀释的洗洁精浸泡5min,自来水冲洗干净后,用稀释5倍的次氯酸钠消毒20min,用无菌水冲洗3次,最后用无菌的滤纸吸干表面水分。
3.如权利要求1所述的一种温山药转基因毛状根的诱导方法,其特征在于所述的步骤
2)中分化培养和生根培养的光照条件为:1000-2000lux。
4.如权利要求1所述的一种温山药转基因毛状根的诱导方法,其特征在于所述的步骤
2)侵染液的制备具体为:将-80℃保存的重组型发根农杆菌K599含有50mg/L Km+50mg/L Str的LB培养基上划线培养;取培养后的单菌落于含有50mg/L Km+50mg/L Str的LB液体培养基中过夜培养;当农杆菌菌液OD值为1.0时,取1mL菌液于1.5mL离心管中,离心、除上清;
用MS添加25mg/L AS液体培养基悬浮菌体,离心、除上清;再用MS液体培养基稀释至OD值为
0.1,用作侵染液。