1.一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法,其特征在于,包括如下步骤:(1)预处理:经过蒸馏水除杂和0.9%NaCl溶液浸泡处理得到预处理摇蚊蛹期蜕皮;
所述蒸馏水除杂操作步骤为:取单个摇蚊蛹期蜕皮,使用25℃蒸馏水浸泡5~8min,之后更换蒸馏水重复1次;
所述0.9%NaCl溶液浸泡处理操作步骤为:蒸馏水除杂后,使用0.9%NaCl溶液浸泡1h,之后更换0.9%NaCl重复2次;
蒸馏水和0.9%NaCl溶液的添加量均为完全没过摇蚊蛹期蜕皮1~2cm高度;
(2)裂解离心:取预处理摇蚊蛹期蜕皮加入裂解液进行研磨,之后8000rpm离心1min,取上清液1;
所述裂解液的成分包括:终质量浓度2%的CTAB、终质量浓度0.5%的SDS、0.03M的EDTA、0.1M的Tris-HCl、1M的NaCl、终质量浓度1%的PVP和终质量浓度0.1%的β-巯基乙醇;
将所述预处理摇蚊蛹期蜕皮先处理成长、宽均小于2mm的小段;
(3)洗脱、富集:将所述上清液1经过硅胶膜离心吸附柱洗脱后得到摇蚊蛹期蜕皮粗DNA;
洗脱液成分包括10mmol/L的Tris-HCl和1mmol/L的EDTA,pH=8.5;
(4)酶解:使用蛋白酶K和RNA酶对摇蚊蛹期蜕皮粗DNA进行酶解,得酶解液;
(5)抽提、离心、沉淀、溶解:将酶解液依次经氯仿-异戊醇、等体积的饱和酚和氯仿-异戊醇、异丙醇和75%乙醇处理后,即得到摇蚊蛹期蜕皮DNA,之后用ddH2O进行溶解;
(6)扩增、电泳检测。
2.如权利要求1所述的一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法,其特征在于,步骤(3)的具体操作为:(31)取硅胶膜离心吸附柱加入上清液1,之后加入等体积0.01mol/L的PBS缓冲液,震荡混匀,将硅胶膜离心吸附柱放入收集管,静止5~8min后,10000rpm离心1min,弃废液;
(32)用洗脱液反复冲洗硅胶膜离心吸附柱,静止5~8min后,10000rpm离心1min,弃废液;
(33)向硅胶膜离心吸附柱中添加65℃预热的洗脱液,充分震荡后室温放置10min,10000rpm离心2分钟,重复1次,收集管中液体即为摇蚊蛹期蜕皮粗DNA。
3.如权利要求1所述的一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法,其特征在于,步骤(4)的具体操作为:向步骤(3)得到的摇蚊蛹期蜕皮粗DNA中添加20μl蛋白酶K及15μl RNA酶,混匀后,68℃水浴进行过夜消化处理,在最初3h内,每30min手动颠倒混合摇匀一次。
4.如权利要求1所述的一种提取单个摇蚊科蛹期蜕皮DNA的方法,其特征在于,步骤(5)的具体操作为:(51)向酶解液中加入氯仿-异戊醇溶液,混匀后静置,之后10000rpm离心25min,取上清液,重复此操作1次,将两次上清液混合得上清液2;
氯仿和异戊醇的体积比为24:1;
(52)向上清液2中加入饱和酚和氯仿-异戊醇溶液,混匀后静置15min,之后8000rpm离心5min,取上清,得上清液3;
所述饱和酚和氯仿-异戊醇溶液体积相等;
氯仿和异戊醇的体积比为24:1;
(53)向上清液3中添加其0.5倍体积的异丙醇,混匀,于冰上沉淀20min,9000rpm离心25min,弃上清,得沉淀1;
(54)向沉淀1中加入75%乙醇,12000rpm离心7min,弃上清,重复该操作1次,即得到摇蚊科蛹期蜕皮DNA;
(55)之后加入ddH2O进行溶解。