1.一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法,其特征在于:包括下述步骤:
(1)选取棉花种子,去除种皮;
(2)无菌苗培养:将步骤(1)的去除种皮后的棉花种子消毒,并接种至无菌苗培养基,进行无菌苗培养,培养过程为,于接种培养2天后将萌发的胚根插入无菌苗培养基中扶苗,扶苗之后继续培养4天得到无菌苗,此过程均于28℃恒温暗培养;
(3)愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导:取步骤(2)无菌苗培养得到的无菌苗,切掉子叶和胚根,下胚轴切为0.6‑0.8 cm茎段并接种于愈伤组织诱导培养基,进行愈伤组织诱导和胚性愈伤组织的诱导,此过程,于28℃恒温光照培养,光照时间为14小时/天,每隔30天继代培养一次,直至分化获得胚性愈伤组织;
(4)胚性愈伤组织的增殖:将步骤(3)得到的刚分化的胚性愈伤组织接种至含终浓度
0.5 mg/L IBA和0.1 mg/L KT的固体MSB培养基上,生长得到淡黄色疏松胚性愈伤组织后将其转移至含终浓度1 g/L NaCl、0.5 mg/L IBA和0.1 mg/L KT的液体MSB培养基上,28℃震荡悬浮光照培养5天完成增殖,光照时间为14小时/天;
(5)基于外源腐胺固液交替培养的胚状体分化调控:将步骤(4)的悬浮培养物过筛,将过筛后的培养物进行沉淀,倒弃沉淀后的上清液,于沉淀中再重新加入少量液体MSB培养基重悬,重悬后接种至胚状体分化调控培养基,进行胚状体分化,此过程,于28℃恒温光照培养,培养时间为4周,光照时间为14小时/天;
(6)生根培养:将步骤(5)培养可见明显子叶的成熟胚状体转移至生根培养基中,于28℃恒温光照培养,进行生根培养,光照时间为14小时/天;
(7)驯化与移栽:将步骤(6)中长出发达根系的植株进行水培炼苗,驯化后移栽至营养土钵中继续生长,此过程,于28℃恒温光照培养,光照时间为14小时/天;
所述步骤(2)中,无菌苗培养基为大量元素减半的MSB培养基;所述步骤(3)中,愈伤组织诱导培养基为含终浓度0.1 mg/L 2, 4‑D和0.1 mg/L KT的MSB培养基;所述步骤(5)中,胚状体分化调控培养基为去掉NH4NO3,且KNO3含量加倍,并含终浓度0.5 mg/L IBA、0.1 mg/L KT和1 mM 腐胺的MSB培养基;所述步骤(6)中,生根培养基为1/2MSB培养基,所述1/2MSB培养基为无机物含量减半,有机物含量不变的MSB培养基;
其中,所述MSB培养基为改良的MSB培养基,其成分如下:硝酸钾1.9 g/L、硫酸铵1.65 g/L、磷酸二氢钾0.17 g/L、七水硫酸镁 0.37 g/L、二水氯化钙0.44 g/L、四水硫酸锰22.3 mg/L 、硼酸6.2 mg/L、七水硫酸锌8.6 mg/L、碘化钾0.83 mg/L、二水钼酸钠 0.25 mg/L、五水硫酸铜0.025 mg/L、六水氯化钴0.025 mg/L、乙二胺四乙酸钠37.3 mg/L、七水硫酸亚铁
27.8 mg/L、甘氨酸2 mg/L、烟酸1 mg/L、盐酸硫胺素10 mg/L、盐酸吡哆醇1 mg/L、肌醇100 mg/L、葡萄糖30 g/L,pH为5.8 6.0;当使用的培养基为固体培养基时,添加植物凝胶2.5 g/~
L。
2.根据权利要求1所述的通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法,其特征在于:所述步骤(2)中,消毒过程为先使用0.1%升汞消毒10分钟,后用无菌水冲洗3‑4次。