1.基于双适配体检测外泌体的生物传感器,其特征在于,包括适配体PTK‑7 Apt、CD63 Apt、connector、发夹探针H1、发夹探针H2、CCRF‑CEM、血红素、鲁米诺、H2O2;
PTK‑7Apt碱基序列如SEQ No.1所示;具体为:ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAA AATACTGTACGGTTAGATTTTTTTTTTTTTTTCATCATCTTACGTGGGGTCTTGCAGTA;
CD63Apt碱基序列如SEQ No.2所示;具体为:CGGAGAAGAAGCAGACTGACA CTAGGTTTTTTTTTTTTTTTCACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA;
Connector碱基序列如SEQ No.3所示;具体为:CCTAGTGTCAGTCTGCCCACGTAAG ATGATG;
H1碱基序列如SEQ No.4所示;具体为:AGGGCGGGTGGGTCTTGCAGTTGGAG AATTGTACTGCAAGACCTTCTTCTCCGTGGGT;
H2碱基序列如SEQ No.5所示;具体为:TGGGTCAATTCTCCAACTGCAA GTCGGAGAAGAAGGTCTTGCAGTTGGGTAGGGCGGG;
PTK‑7 Apt序列中的ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA是PTK‑7的aptamer,CD63 Apt序列中的CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA是CD63的aptamer;PTK‑7 Apt序列中的CATCATCTTACGTGG、CD63 Apt序列中的GCAGACTGACACTAGG分别是connector序列中的CCACGTAAGATGATG和CCTAGTGTCAGTCTGC的互补序列;当目标物存在时,目标物与PTK‑
7 Apt和CD63 Apt特异性结合,connector与PTK‑7 Apt和CD63 Apt互补配对,将两条链拉近,PTK‑7 Apt序列中的GGTCTTGCAGTA和CD63 Apt序列中的CGGAGAAGAA作为trigger去触发HCR反应;H1序列中的AGGGCGGGTGGGT、TGGGT和H2序列中的TGGGT、TGGGTAGGGCGGG是劈开的G四联体序列;PTK‑7 Apt 序列中的GGTCTTGCAGTA和CD63 Apt序列中的CGGAGAAGAA是H1序列中的TACTGCAAGACCTTCTTCTCCG的互补序列,将H1打开,H1序列中的CTTGCAGTTGGAGAATTG与H2序列中的CAATTCTCCAACTGCAAG部分互补,将H2打开,H2序列中的TCGGAGAAGAAGGTCTTGCAGT与H1序列中的TACTGCAAGACCTTCTTCTCCG互补,又将H1打开,进而触发HCR;通过上述反应循环实现指数放大,产生大量的G四联体从而实现信号放大;进而通过测量化学发光强度来定量检测外泌体。
2.权利要求1所述的生物传感器检测外泌体的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)外泌体提取;
(2)均相反应:将外泌体与PTK‑7 Apt、CD63 Apt 加入到5×PBS buffer中,同时加入Connector、H1、H2,混合均匀后孵育;
(3)加入血红素、鲁米诺、H2O2,荧光检测。
3.根据权利要求2所述的检测外泌体的方法,其特征在于,所述步骤(1)外泌体提取的步骤如下:CCRF‑CEM细胞培养在37°C包含5% CO2 潮湿空气中,每四天传代一次,培养基为RPMI‑
1640 4.5g/L、10%特级胎牛血清FBS、1%抗生素,将细胞碎片以2000g离心20min,将细胞碎片从培养基中移除,在10000g离心45min,0.20μm注射器过滤器过滤,10000g离心150min获取外泌体,然后将外泌体加入PBS,‑80°C储存待用。
4.根据权利要求3所述的检测外泌体的方法,其特征在于,所述的抗生素为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。
5.根据权利要求2所述的检测外泌体的方法,其特征在于,所述步骤(2)均相反应操作步骤如下:S1 将外泌体与PTK‑7 Apt、CD63 Apt、5×PBS buffer混合,反应30min;
S2加入Connector、H1、H2,反应90min。
6.根据权利要求2所述的检测外泌体的方法,其特征在于,所述的步骤(3)过程为:加入血红素,鲁米诺37°C反应30min;之后加入H2O2,立即用于化学发光信号的检测,化学发光信号采集时间间隔是1.5s,化学发光光谱测量范围是350nm到550nm。
7.权利要求1所述的生物传感器用于非疾病诊断目的的肿瘤外泌体检测的应用。