1.spkD基因在不饱和脂肪酸合成中的应用,所述spkD基因核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
2.如权利要求1所述spkD基因在不饱和脂肪酸合成中的应用,其特征在于,所述spkD基因作为调控亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸和十八碳四烯酸表达量的基因。
3.一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法I,其特征在于,包括步骤如下:(1)用引物对spkD-F,spkD-R对集胞藻PCC6803基因组DNA进行PCR扩增,得到spkD基因;
(2)扩增后的spkD片段与pClone007 simple载体连接,然后转化入大肠杆菌DH5α中进行克隆,得到007-spkD质粒;
(3)将007-spkD质粒使用EcoR I内切酶进行酶切,将spkD基因切开,EcoR I内切酶的酶切位点前的spkD基因片段作为同源重组上游臂,酶切位点后的spkD基因片段作为同源重组下游臂;
(4)用EcoR I内切酶酶切质粒pBluescript-Kan,回收卡那霉素片段,与同样经EcoR I内切酶酶切的步骤(3)制得的质粒007-spkD连接,制得质粒007-spkD-kan;
(5)将步骤(4)制得的重组载体007-spkD-kan转化到集胞藻PCC6803,经筛选,制得敲除spkD基因的集胞藻突变株。
4.如权利要求2所述,调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法I,其特征在于,所述步骤(1)中,spkD基因以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板,进行PCR扩增获得,PCR扩增引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2;
优选的,所述步骤(1)中,PCR扩增体系如下:
2x M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μL,模板DNA 1μL,引物spkD-F 1μL,引物spkD-R 1μL,ddH2O 7μL,共计20μL;
PCR扩增程序如下:
95℃预变性3min,94℃变性25s,60℃复性25s,72℃延伸l min,35个循环后,72℃终延伸5min,4℃保存。
5.权利要求3制备的敲除spkD基因的集胞藻突变株用于不饱和脂肪酸的合成。
6.spkG基因在不饱和脂肪酸合成中的应用,所述spkG基因核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
7.如权利要求6所述,其特征在于,所述spkG基因作为调控亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸和十八碳四烯酸表达量的基因。
8.一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法II,其特征在于,包括步骤如下:a用引物对spkG-F,spkG-R对集胞藻PCC6803基因组DNA进行PCR扩增,得到spkG基因;
b扩增后的spkG片段与pClone007 simple载体连接,然后转化入大肠杆菌DH5α中进行克隆,得到007-spkG质粒;
c将007-spkG质粒使用BamHⅠ内切酶进行酶切,将spkG基因切开,BamHⅠ内切酶的酶切位点前的spkG基因片段作为同源重组上游臂,酶切位点后的spkG基因片段作为同源重组下游臂;
d用BamHI内切酶酶切质粒pBluescript-Kan,回收卡那霉素片段,与同样经BamHI内切酶酶切的步骤c制得的质粒007-spkG连接,制得质粒007-spkG-kan;
e将步骤d制得的重组载体007-spkG-kan转化到集胞藻PCC6803,经筛选,制得敲除spkG基因的集胞藻突变株。
9.如权利要求7所述调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法II,其特征在于,所述步骤a中,spkG基因以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板,进行PCR扩增获得,PCR扩增引物核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;
优选的,所述步骤a中,PCR扩增体系如下:
2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μL,模板DNA 1μL,引物spkG-F 1μL,引物spkG-R1μL,ddH2O 7μL,共计20μL;
PCR扩增程序如下:
95℃预变性3min,94℃变性25s,60℃复性25s,72℃延伸lmin,35个循环后,72℃终延伸
5min,4℃保存。
10.权利要求7制备的敲除spkG基因的集胞藻突变株用于不饱和脂肪酸的合成。