1.一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,该方法步骤如下:
1)病毒的收集及样品的处理:收集感染囊泡病毒的待测样品,超声破碎,稀释后过滤;
其中,囊泡病毒为HvAV;
2)细胞感染及计数:将昆虫细胞接种于6孔板中,加入步骤1)得到的囊泡病毒稀释液,恒温箱培养,收集囊泡病毒细胞,计数;
3)病毒基因组拷贝数的计算:以步骤2)收集到的细胞提取基因组DNA,以提取的DNA为模板进行绝对定量PCR检测;以含有该DNA片段的pGEM‑T载体为标准品,绘制绝对定量PCR检测的标准曲线;对待测样品进行qPCR检测,根据所产生的Ct值基于该标准曲线计算样品中含有的病毒基因组拷贝数;其中,绝对定量PCR检测囊泡病毒HvAV的引物序列为:AV‑F:ATGAAAGCCGTGCTTAACGT,AV‑R:CTAGCCGGTGTGGTGGGTGT;
4)囊泡病毒滴度计算:基于步骤3)得到的病毒基因组拷贝数及步骤2)的病毒细胞数量,病毒基因组拷贝数等于病毒粒子数,根据感染复数公式,计算感染每个细胞的平均病毒粒子数量,即得样品中的囊泡病毒滴度。
2.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述步骤3)中绝对定量PCR检测所用引物是对应所述病毒设计的。
3.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述骤3)中绝对定量PCR扩增反应体系为:SYBR Primix Ex Tap II:5μL,DNA模板:0.5μL,上游引物:0.4μL,下游引物:0.4μL,加水至10μL。
4.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述骤3)中绝对定量PCR扩增反应程序为:95℃预变性1s,然后95℃10s、55℃10s、72℃35s,共40个循环。
5.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于, 2 11
所述步骤1)待测样品稀释液中囊泡病毒浓度为1×10 ~1×10 病毒基因拷贝/mL。
6.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述步骤2)中昆虫细胞为草地贪夜蛾卵巢细胞Sf9细胞、草地贪夜蛾卵巢细胞Sf21细胞或甜菜夜蛾脂肪体细胞系SeFB细胞。
7.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,5
所述步骤2)中昆虫细胞的个数为1.0~9.9×10个/mL。
8.如权利要求1所述的一种快速测定囊泡病毒滴度的绝对定量PCR方法,其特征在于,所述步骤2)培养温度为27℃,时间为1h。