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专利号: 2019112649468
申请人: 淮阴师范学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-03-20
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法,其特征在于,所述的方法是利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻分蘖数调控基因OsFWL4,所述水稻分蘖数调控基因OsFWL4,其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻分蘖数调控基因OsFWL4,其具体步骤为:

1)在水稻分蘖数调控基因OsFWL4的编码区选取靶标片段;

2)根据靶标片段的序列信息,合成带有粘性末端的接头引物,构建用于OsFWL4基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体;所述重组载体包括能在水稻细胞中表达的具有所述靶标序列的sgRNA表达盒和Cas9核酸酶表达盒;

3)将所述重组载体转入根癌农杆菌工程菌株中,利用农杆菌介导法转化常规粳稻品种,获得转基因水稻植株;

4)利用覆盖靶标位点的基因组引物对转基因植株基因组DNA进行扩增和序列测定,从而对T0代转基因植株进行基因型鉴定,获得纯合或双等位突变体;

5)利用生物信息学工具,对靶标序列的潜在脱靶位点进行预测;然后,利用基因组引物分别对纯合或双等位T0代突变体中预测概率最高的两个脱靶位点进行PCR扩增和序列测定,获得无可检测脱靶效应的纯合或双等位突变体;

6)对上述无可检测脱靶效应的纯合或双等位突变体在T1代进行种植,利用引物对T1代植株中的HPT、sgRNA和Cas9转基因进行PCR检测,即可获得无转基因插入、无可检测脱靶效应、单株分蘖数和产量显著增加的水稻。

3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤1)中,所述靶标片段双链结构中的一条链具有5’-(N)x-NGG-3’结构,其中,N为A、T、C、G四种碱基中任意一个,X为19或20;所述靶标片段与水稻基因组中的相似序列具有两个或两个以上的错配。

4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,步骤1)中,所述靶标片段有两个,其序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤2)中,所述sgRNA表达盒的核苷酸序列如Seq ID No.3所示;所述Cas9核酸酶表达盒的核苷酸序列如Seq ID No.4所示。

6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤6)中,用于HPT、sgRNA和Cas9转基因扩增的引物序列分别为:HPTF:5’-GGGTGTCACGTTGCAAGACC-3’,

HPTR:5’-ATGCCTCCGCTCGAAGTAGC-3’,

sgRNAF:5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’,sgRNAR:5’-GGCCATTTGTCTGCAGAAT-3’,Cas9F:5’-CACCATCTACCACCTGAGAA-3’,Cas9R:5’-CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG-3’。

7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤5)中,所述生物信息学工具为CRISPR-P 2.0或者CRISPR-GE。