1.一种具有抗氧化活性的小球藻胞外多糖,其特征在于,由盐胁迫协同光‑暗交替模式液体培养的小球藻分泌和分离纯化得到,所述的小球藻胞外多糖平均相对分子量为131.79 kDa,主要由摩尔百分比分别为19.81%、79.93%和0.25%的木糖、甘露糖和核糖组成;所述盐胁迫协同光‑暗交替模式液体培养的小球藻分泌和分离纯化,具体如下:
1)盐胁迫协同光‑暗交替模式液体培养小球藻将小球藻藻种Chlorella protothecoides CS‑41接种于Basal固体培养基上,光照培养5天获得复壮小球藻藻种,将复壮小球藻藻种挑取单菌落接种于液体Basal培养基中光照培养5天,获得一级小球藻种子液,以5%接种量将一级小球藻种子液接种到液体Basal培养基中,黑暗培养5天获得二级种子液,接着向含10‰盐度氯化钠的Basal液体培养基中接种
1%的二级种子液,并在8h光照:16h黑暗的光‑暗交替模式下培养7天获得小球藻培养液;
2)小球藻胞外多糖分离纯化与制备
将步骤1)中培养7天获得的小球藻培养液在8000 rpm离心15 min,收集上清,并用蒸馏水洗涤离心管底小球藻泥3 5次,合并所有上清,将合并所得上清液进行减压浓缩,以4倍浓~
缩液体积的无水乙醇醇沉过夜,离心收集获得沉淀物,将醇沉获得的沉淀物用蒸馏水进行复溶,将三氯甲烷、异丙醇体积比为4:1的三氯甲烷‑异丙醇复合试剂加入复溶样品溶液剧烈震荡5 min以除去蛋白质,其中,复溶样品溶液和复合试剂的体积比为1:1,后静置分层取最上层溶液重复2 3次后合并所有上层溶液进行透析、冷冻干燥获得小球藻胞外粗多糖;
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将上述制得的小球藻胞外粗多糖重溶于20 mM,pH为7.4的Tris‑HCl缓冲液,上样至DEAE Sepharose F.F. 阴离子交换层析柱中,并分别用0、0.1、0.3 mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱,并同步收集0.3 mol/L NaCl洗脱峰组分,同时采用蒽酮‑硫酸法监测各离心管洗脱液中糖含量并绘制洗脱曲线,并同步收集0.3 mol/L NaCl洗脱峰组分,将收集的洗脱峰组分经透析、冷冻干燥处理后重新溶解于0.01 mol/L NaCl中,随后上样至Sephadex G‑75凝胶柱中,以0.01 mol/L NaCl为流动相进行洗脱,采用蒽酮‑硫酸法监测各管洗脱液中的糖含量并绘制洗脱曲线,收集洗脱峰组分,经透析、浓缩、冷冻干燥处理后获得纯化小球藻胞外多糖。