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专利号: 2019111247528
申请人: 徐州工程学院
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-12-30
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法,其特征在于,具体步骤如下:

第一步、设计扩增AaIT基因引物,引物设计时分别引入BamHI和EcoRI酶切位点,利用设计的引物从pUC57-AaIT中扩增AaIT基因序列;

第二步、AaIT基因的PCR扩增产物经纯化后,用BamHI和EcoRI酶进行酶切,同时用BamHI和EcoRI酶酶切pbarGPEl;,分别进行纯化后,建立连接反应体系连接AaIT基因和pbarGPEl;

第三步、连接产物转化大肠杆菌感受态细胞并进行验证,构建成pbarGPEl-AaIT载体;

第四步、设计含Not1酶切位点的引物,从pbarGPEl-AaIT载体扩增出GpdA-AaIT-TrpC表达盒;

第五步、用Not1酶酶切pGPS3Ben-bbchit1,并进行去磷酸化处理;

第六步、将第五步得到的去磷酸化处理的pGPS3Ben-bbchit1和GpdA-AaIT-TrpC表达盒连接,获得pGPS3Ben-bbchit1-AaIT表达载体,转化大肠杆菌,提取质粒;

第七步、第六步提取的质粒采用冻融法导入根癌农杆菌感受态细胞中,进行抗性筛选,获取根癌农杆菌阳性菌落;

第八步、球孢白僵菌孢子悬液和含pGPS3Ben-bbchit1-AaIT载体的根癌农杆菌菌液混合,经在固体IM培养基上共培养和CPZ选择培养基上多次筛选获得转化工程菌株。

2.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法,其特征在于:所述第一步中扩增AaIT基因引物分别引入BamHI和EcoR1酶切位点,引物序列为:AaIT-F(BamHI)如

5'-SEQ ID NO:1-3'所示;AaIT-R(EcoRI)如5'-SEQ ID NO:2-3'所示。

3.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法,其特征在于:所述第二步中所用pbarGPEl载体含有BamHI和EcoRI酶切位点。

4.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法,其特征在于,所述第二步中连接反应体系中AaIT和pbarGPEl的浓度摩尔比为3:1。

5.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法,其特征在于:所述第三步中所用大肠杆菌感受态为DH-5α。

6.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法,其特征在于:所述第四步中从pbarGPEl-AaIT载体扩增GpdA-AaIT-TrpC所用的正反引物序列均含Not1酶切位点。

7.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法,其特征在于:所述第七步中悬菌体是涂布在含氨苄和苯菌灵的YEB平板上,其中氨苄和苯菌灵浓度分别为12.0μg/m和8.0μg/mL。

8.根据权利要求1所述的一种杀虫球孢白僵菌工程菌构建方法,其特征在于:所述第八步中固体IM培养基上含:NaCl 0.03%(w/v),MgS04.7H20 0.03%(w/v),K2HP040.03%(w/v),甘油0.5%(v/v),MES 0.04mmo1/L,还包括3.5mmol/L葡萄糖和350mmol/L乙酰丁香酮。