1.一种检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，所述检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法包括以下步骤：步骤一，将芍药素、天竺葵素、锦葵素、矢车菊素、飞燕草素以及矮牵牛素六种花青素分别溶于二甲基亚砜，配置为400mM储备浓度，于-20℃避光保存；

步骤二，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养大鼠胰岛β细胞；

步骤三，花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查；

步骤四，利用流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；

步骤五，活性氧自由基ROS水平实验验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；

步骤六，细胞凋亡蛋白表达水平验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型；

步骤七，利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果；

步骤八，建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株：包括慢病毒载体构建、慢病毒的包装制备、稳定细胞株的筛选；

步骤九，利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果；

步骤十，结合花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生的自噬体和自噬流效果进行判断。

2.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤三中花青素对大鼠胰岛β细胞毒性浓度范围的筛查包括以下步骤：

1)将含2×104个细胞悬浮液接种于96孔板中，每孔取200μL，放置在37℃培养箱培养

12h；

2)细胞单层贴壁生长后，按照终浓度为25-200μM添加六种花青素于37℃培养箱继续培养8h；

3)培养结束后，每孔按照1:10的比例加入20μLCCK-8溶液继续培养2h；

4)使用酶标仪在450nm测定各个样品的OD值；

5)同时设置空白组，只加入培养基和CCK-8试剂；阴性组不加待测药物细胞孔，每组设定5个复孔；并根据公式计算出细胞存活率；

细胞活力(％)＝(处理组OD-空白组OD)/(阴性组OD-空白组OD)×100％，细胞毒性(％)＝(阴性组OD-处理组OD)/(阴性组-空白组)×100％。

3.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤四中利用流式细胞技术构建高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型包括以下步骤：

1)将5×105个细胞悬浮液接种于12孔细胞板中，培养12h；

2)每孔加入终浓度10、20和30mM的葡萄糖后分别培养24、36以及48h；

3)培养结束后，将每孔培养基分别吸入到离心管(1)中，用PBS清洗每孔1次并转入到对应的离心管(1)中；

4)然后每孔加入200-300ul不含EDTA的胰酶，消化细胞30s后直接加入2mL10％胎牛血清的RPMI 1640培养液轻轻吹打，让贴壁细胞悬浮于培养液中，再移入到新的离心管(2)中；

5)将离心管(2)在1000rpm条件下离心8min，再将上清液转入到对应的离心管(1)中，在

3000rpm条件下离心8min，去除上清液；

6)用2mLPBS分别加入到离心管(1)和(2)中，用移液枪轻柔重悬细胞；

7)将离心管(1)中的悬浮细胞分别用1000rpm×8min再次离心一次，将上清液转入到对应的离心管(2)中，3000rpm×8min离心，去除上清液；

8)加入300-500ul的Bindbuffer重悬细胞，将离心管(1)和对应(2)细胞混合；

9)轻柔混匀之后，过200目细胞筛至离心管中，得到待测细胞悬浮液；

10)使用流式细胞仪器前，每处理500uL加入5ulAnnexin-V-FICT，室温孵育10min，混匀；

11)随后加入5ul PI混匀，室温孵育5min；

12)用激发波长Ex＝488nm，发射波长Em＝530nm流式细胞仪器检测大鼠胰岛β细胞凋亡情况；

13)根据大鼠胰岛β细胞凋亡情况，确定大鼠胰岛β细胞凋亡模型条件为30mM和36h。

4.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤五中活性氧自由基ROS水平实验包括以下步骤：

1)通过荧光探针DCFH-DA标记细胞内ROS水平；

2)按照细胞免疫荧光方法制备细胞爬片；以终浓度为50μmol/L的DCFH-DA加入各组处理组中，在37℃孵育50min，随后用PBS洗3遍；分别采用488nm和510nm的最大激发波长和发射波长检查细胞的荧光强度，拍照。

5.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤六中细胞凋亡蛋白表达水平验证高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型包括以下步骤：

1)细胞培养：RIN-m5F细胞株用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基在37℃、100％饱和湿度、5％CO2条件下常规传代培养；

2)蛋白回收：待细胞处理结束后，弃培养液，用预冷的PBS洗两遍；每孔加入10％SDS；充分混匀后移至新离心管中，冰上孵育20-30min，置100℃金属浴10min，随后加入6×loading Buffer，充分振荡混匀，再次100℃金属浴10min，置-80℃冰箱保存备用；

3)蛋白定量：根据BSA试剂盒配置不同浓度BSA标准品、工作液；将不同浓度的BSA标准品和待测蛋白样品分别加入96孔板板中于37℃孵育30min，每组做5个平行；在562nm下，测定吸光值；根据BSA标准品标准曲线计算出样品中蛋白浓度；

4)蛋白印迹检测：浓缩胶和分离胶的配置，Caspase 3选择10％-12％的分离胶；

a.电泳：将配置好的胶装入电泳槽中，加入5-20μL待测蛋白至每个泳道；根据Caspase 

3蛋白分子量电压稳定在50-80v，电泳1-2.5h；

b.转膜：根据分子大小将目标蛋白核对后切下胶块，然后将蛋白按照三明治的夹心方式放入装膜槽中；

c.封闭：将膜用封闭液封闭，于摇床上孵育1h；

d.一抗体孵育：一般用1:1000的比例稀释一抗于4℃冰箱孵育过夜，去除一抗，用TPBST将膜清洗三次，每次5-10min；

e.二抗体孵：一般用1:5000的比例稀释二抗，摇床下孵育1h，吸去二抗，PBST将膜清洗三次，每次5-10min；

f.加入化学发光显色液后，通过Image Quant LAS 4000mini凝胶成像仪显影，拍照，保存；用Image J分析软件对各个条带进行定量分析。

6.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤七中利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬体效果包括以下步骤：

1)在正常条件下和高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型中，将含1×105个的细胞悬浮液分别接种于已铺入玻片的12孔培养板中培养12h；

2)每孔中加入50μM的花青素溶液，培养8h；

3)用移液枪吸除培养液，用PBS洗2～3遍；加入4％多聚甲醛室温固定10min，弃多聚甲醛，继续用PBS洗3遍；去掉PBS，加入10％的山羊血清制成的封闭液，室温封闭30min；

4)在10％的山羊血清制成的封闭液中添加0.1％皂素制成稀释剂，稀释剂与一抗体LC3，(MBL,PM036)按照1：1000混合，将爬片覆于一抗稀释液上，于37℃避光孵育1h；

5)将爬片用封闭液洗三遍；

6)孵育二抗GoatAnti-Rabbit IgG(Southern Biotech,4050-05)，方法同一抗，将爬片用封闭液三遍；

7)滴适量封片剂在载玻片上，将爬片正面朝下覆于封片剂上，避光干燥；

8)采用激光共聚焦显微镜观察荧光点状聚集数目即为自噬体的数目，点状密集程度可以初步评价大鼠胰岛β细胞产生自噬体能力；当自噬发生后，弥散分布在细胞质中的LC3-I经泛素化加工修饰与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺PE结合形成LC3-II；通过细胞免疫荧光的方法采用激光共聚焦观察点状聚集的数目即为自噬体的数目，点状密集程度可以初步评价细胞自噬；

9)拍照。

7.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤八中建立RFP-GFP-RIN稳定细胞株包括以下步骤：

1)通过PCR技术从PCMV-RFP-GFP-LC3质粒中扩增RFP-GFP-LC3片段；扩增产物经10g/L琼脂转化、筛选出重组质粒，得到RFP-GFP-LC3-GV374质粒；经过测序比对确认慢病毒载体构建成；

2)将293FT细胞培养至90％，用胰酶消化后以1×106/mL密度传代至细胞平板中培养

24h；待细胞生长对数期进根据Lipo3000转染试剂盒的说明书操作；培养24h后收集细胞上清液，3000r/min，离心10min，取上清液；

3)将收集的慢病毒颗粒加入至RIN-m5F细胞中培养48h；期间观察并更换新培养基，待培养结束后，加入体积比为6μg/mL嘌呤霉素进行筛选感染的RIN-m5F细胞；培养7天后，通过荧光显微镜下筛选出带有红色与绿色荧光的细胞；挑选出阳性克隆细胞，转移到新的培养皿中继续培养得到RFP-GFP-LC3胰岛β稳定细胞株。

8.如权利要求1所述的检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法，其特征在于，步骤九中利用细胞免疫荧光法检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞产生自噬流效果包括以下步骤：

1)在高糖大鼠胰岛β细胞凋亡模型中，将含1×105/mL RFP/GFP-LC3稳定的细胞株的悬浮液接种于已铺入玻片的培养板中；

2)将50μM花青素与20μM氯奎添加每孔中培养2h，再加入30mM葡萄糖培养36h；

3)反应结束后去掉培养基，用PBS洗爬片2～3遍；加入4％多聚甲醛室温固定10min，弃多聚甲醛，继续用PBS洗3遍；

4)滴适量封片剂在载玻片上，将爬片正面朝下覆于封片剂上，避光干燥；

5)采用激光共聚焦显微镜观察显微镜观察红色荧光/绿色荧光的比例判断自噬流，拍照。

9.一种如权利要求1～8任意一项所述检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬效果的方法在筛选花青素诱导大鼠胰岛β细胞的自噬效果中的应用。

10.一种如权利要求1～8任意一项所述检测花青素诱导大鼠胰岛β细胞自噬作用预防糖尿病的应用。