1.一种sgRNA,其特征在于,所述sgRNA的序列为:SEQ ID NO:5。
2.一种由权利要求1所述sgRNA构建的转基因表达载体。
3.一种如权利要求2所述转基因表达载体的构建方法,其特征在于,所述转基因表达载体的构建方法包括:(1)在let-7C所在基因组上找到合适的sgRNA靶定位点,符合G(N19)NGG结构;
(2)sgRNA表达载体用U6启动子同时表达两个sgRNA,筛选标记选用在眼睛和神经特异表达的启动子3XP3启动绿色荧光EGFP,转基因载体以鳞翅目昆虫转座子piggyBac为转基因基本骨架。
4.如权利要求3所述的转基因表达载体的构建方法,其特征在于,所述转基因表达载体的构建方法具体包括:
1)利用在线预测网站CCtop预测敲除let-7C所需的sgRNA spacer,输入let-7C所在的基因组序列,以G(N20)GG的结构找寻序列中的gRNA spacer,避免脱靶率较高的序列;在sgRNA spacer序列的5’末端加入相应的碱基:TGCA和AAAC用于Aar I酶切后的连接,TCCG和AAAC用于BbaI酶切后的连接;
2)以下列条件让引物退火形成双链:95℃变性5min,95℃梯度降温到25℃,每秒下降
0.1℃,共700个循环;
3)配制以下体系,37℃酶切过夜后回收pUC57[U6-2gRNA]载体骨架;
4)将sgRNA1-spacer退火形成的双链连接到pUC57[U6-2gRNA]载体骨架上,构建成pUC57[U6-sgRNA1]质粒;
5)配制以下体系,37℃酶切4h后,回收pUC57[U6-sgRNA1]载体骨架;
6)将sgRNA2-spacer退火形成的双链连接到pUC57[U6-sgRNA1]载体骨架上,构建成pUC57[U6,let-7C-2gRNA]质粒;
7)配制以下体系,37℃酶切4h后,回收[U6,let-7C-2gRNA]片段;
8)将回收的let-7C敲除双sgRNA表达片段[U6,let-7C-2gRNA]连接到piggyBac[3xP3-EGFP]载体上,构建成let-7C敲除双gRNA转基因表达载体:pBac[3xp3-EGFP,let-7C-
2gRNA]。
5.一种基于权利要求2所述sgRNA转基因表达载体的let-7C丝腺敲除品系筛选方法,其特征在于,利用CRISPR/Cas9系统,首先建立一个表达let-7C敲除所用sgRNA的品系,将该品系与特定Cas9表达品系进行杂交,实现let-7C在家蚕丝腺中的敲除;具体是将sgRNA表达品系与中部丝腺、后部丝腺Cas9表达品系分别进行了杂交,获得了let-7C在中部丝腺特异敲除的品系[Δlet-7C-MSG]和let-7C后部丝腺特异敲除品系[Δlet-7C-PSG]。
6.如权利要求5所述的let-7C敲除品系筛选方法,其特征在于,所述let-7C敲除品系筛选方法具体包括:第一步,双gRNA转基因载体注射及阳性个体筛选,将sgRNA转基因表达质粒通过显微注射方法注射到刚产下的蚕卵中,将成功孵化的幼虫用新鲜桑叶饲养,得到G0代成虫,G0代成虫交配得到G1代蚕卵;蚕卵催青至5-6天时进行绿色荧光筛选;A、A#表示G1代筛到的眼睛发绿光的阳性蚕卵;B、B#表示G1代阳性成虫;
第二步,sgRNA表达品系与Cas9表达品系进行杂交,筛选let-7C敲除品系;
(1)A.[let-7C-2gRNA]个体;B.[Cas9-MSG]个体;C.同时表达绿光和红光的个体为杂交个体,即为let-7C中部丝腺敲除个体[Δlet-7C-MSG];
(2)A.[let-7C-2gRNA]个体;B.[Cas9-PSG]个体;C.同时表达绿光和红光的个体为杂交个体,即为let-7C后部丝腺敲除个体[Δlet-7C-PSG];
第三步,测序验证基因组上序列变化,证明let-7C被敲除;在let-7C上下游设计引物,扩增出这段序列,通过测序的方法,鉴定家蚕丝腺细胞基因组DNA发生的变化;与正常序列比较,两个不同的sgRNA靶点处都发生了不同形式的碱基缺失,缺失2-83个碱基不等。
7.如权利要求6所述的let-7C后部丝腺敲除品系筛选方法,其特征在于,所述第一步具体包括:(1)提取pBac[3xp3-EGFP,let-7C-2gRNA]超纯质粒,与实验室保存的表达piggyBac转座酶的辅助载体pHA3PIG超纯质粒按摩尔比1:1混合;将混合后的质粒用显微注射仪注射到产卵后一小时以内的D9L蚕卵中,然后用无毒瞬干胶封闭注射孔;
(2)将注射后的蚕卵放入25℃,相对湿度90%的生化培养箱进行催青,9-10天后,用新鲜桑叶对家蚕幼虫进行饲养,此为G0代幼虫;
(3)将G0代幼虫饲养至成虫并自交,获得G1代产卵,催青至第5-6天,用宏观电动荧光显微镜进行转基因阳性个体筛选;采用EGFP荧光蛋白为报告基因,所以G1代中胚胎眼睛发绿光的为阳性个体,命名为[let-7C-2gRNA];
(4)G1代饲养至成虫,对成虫复眼再次进行绿色荧光筛选,筛选到的阳性个体用于后续的杂交实验。
8.如权利要求6所述的let-7C中部丝腺敲除品系筛选方法,其特征在于,所述第二步具体包括:
1)将[let-7C-2gRNA]品系分别与中部丝腺Cas9表达品系[Cas9-MSG]和后部丝腺Cas9表达品系[Cas9-PSG]进行杂交;
2)杂交得到的F1代蚕卵放入25℃、相对湿度90%的生化培养箱中进行催青,催青至5-6天时,用宏观电动荧光显微镜进行报告基因筛选;F1代胚胎眼睛同时发绿光和红光的即为let-7C中部丝腺敲除个体[Δlet-7C-MSG]和let-7后部丝腺敲除个体[Δlet-7C-PSG]。
9.如权利要求6所述的let-7C中部丝腺敲除品系筛选方法,其特征在于,所述第三步具体包括:(1)将筛选到的[Δlet-7C-MSG]和[Δlet-7C-PSG]幼虫用新鲜桑叶饲养至五龄,解剖获得丝腺材料;
(2)利用组织DNA提取试剂盒,提取丝腺细胞总DNA;
(3)设计引物对靶位点序列进行扩增,并连接到pMD-19-T simple载体上进行测序;
(4)用BioEidt软件对序列进行比对分析,鉴定碱基缺失数目。
10.一种如权利要求5~9任意一项所述let-7C丝腺敲除品系筛选方法在提高家蚕丝腺发育和吐丝量中的应用,其特征在于,获得let-7C在中部丝腺特异敲除的品系[Δlet-7C-MSG]和let-7C后部丝腺特异敲除品系[Δlet-7C-PSG]。