1.一种let‑7C丝腺敲除品系筛选方法,其特征在于,利用CRISPR/Cas9系统,首先建立一个表达let‑7C敲除所用sgRNA的品系,将该品系与特定Cas9表达品系进行杂交,实现let‑
7C在家蚕丝腺中的敲除;具体是将sgRNA表达品系与后部丝腺Cas9表达品系分别进行了杂交,获得了let‑7C后部丝腺特异敲除品系[Δlet‑7C‑PSG]。
2.如权利要求1所述的let‑7C丝腺敲除品系筛选方法,其特征在于,所述let‑7C敲除品系筛选方法具体包括:第一步,双gRNA转基因载体注射及阳性个体筛选,将sgRNA转基因表达质粒通过显微注射方法注射到刚产下的蚕卵中,将成功孵化的幼虫用新鲜桑叶饲养,得到G0代成虫,G0代成虫交配得到G1代蚕卵;蚕卵催青至5‑6天时进行绿色荧光筛选;
第二步,sgRNA表达品系与Cas9表达品系进行杂交,筛选let‑7C敲除品系;
A.[let‑7C‑2gRNA]个体;B.[Cas9‑PSG]个体;C.同时表达绿光和红光的个体为杂交个体,即为let‑7C后部丝腺敲除个体[Δlet‑7C‑PSG];
第三步,测序验证基因组上序列变化,证明let‑7C被敲除;在let‑7C上下游设计引物,扩增出这段序列,通过测序的方法,鉴定家蚕丝腺细胞基因组DNA发生的变化;与正常序列比较,两个不同的sgRNA靶点处都发生了不同形式的碱基缺失,缺失2‑83个碱基不等。
3.如权利要求2所述的let‑7C丝腺敲除品系筛选方法,其特征在于,所述第一步具体包括:(1)提取pBac[3xp3‑EGFP,let‑7C‑2gRNA]超纯质粒,与实验室保存的表达piggyBac转座酶的辅助载体pHA3PIG超纯质粒按摩尔比1:1混合;将混合后的质粒用显微注射仪注射到产卵后一小时以内的D9L蚕卵中,然后用无毒瞬干胶封闭注射孔;
(2)将注射后的蚕卵放入25℃,相对湿度90%的生化培养箱进行催青,9‑10天后,用新鲜桑叶对家蚕幼虫进行饲养,此为G0代幼虫;
(3)将G0代幼虫饲养至成虫并自交,获得G1代产卵,催青至第5‑6天,用宏观电动荧光显微镜进行转基因阳性个体筛选;采用EGFP荧光蛋白为报告基因,所以G1代中胚胎眼睛发绿光的为阳性个体,命名为[let‑7C‑2gRNA];
(4)G1代饲养至成虫,对成虫复眼再次进行绿色荧光筛选,筛选到的阳性个体用于后续的杂交实验。
4.如权利要求2所述的let‑7C丝腺敲除品系筛选方法,其特征在于,所述第二步具体包括:
1)将[let‑7C‑2gRNA]品系分别与后部丝腺Cas9表达品系[Cas9‑PSG]进行杂交;
2)杂交得到的F1代蚕卵放入25℃、相对湿度90%的生化培养箱中进行催青,催青至5‑6天时,用宏观电动荧光显微镜进行报告基因筛选;F1代胚胎眼睛同时发绿光和红光的即为let‑7后部丝腺敲除个体[Δlet‑7C‑PSG]。
5.如权利要求2所述的let‑7C丝腺敲除品系筛选方法,其特征在于,所述第三步具体包括:(1)将筛选到[Δlet‑7C‑PSG]幼虫用新鲜桑叶饲养至五龄,解剖获得丝腺材料;
(2)利用组织DNA提取试剂盒,提取丝腺细胞总DNA;
(3)设计引物对靶位点序列进行扩增,并连接到pMD‑19‑T simple载体上进行测序;
(4)用BioEidt软件对序列进行比对分析,鉴定碱基缺失数目。
6.一种如权利要求1~5任意一项所述let‑7C丝腺敲除品系筛选方法在提高家蚕丝腺发育和吐丝量中的应用,其特征在于,获得let‑7C后部丝腺特异敲除品系[Δlet‑7C‑PSG]。