1.一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)克隆柑橘CsXTH04基因片段,然后进行干扰表达载体构建;
(2)干扰表达载体转化柑橘,得到转基因植株;
CsXTH04的CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
2.根据权利要求1所述的一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于,步骤(1)中,克隆CsXTH04基因片段所采用的引物为RNAi‑CsXTH04‑F和RNAi‑CsXTH04‑R,分别具有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于,步骤(1)中,柑橘CsXTH04基因片段的克隆方法为:提取柑橘总RNA,然后反转录为cDNA,最后采用高保真酶PCR扩增得到CsXTH04基因片段。
4.根据权利要求1所述的一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于,步骤(1)中,干扰表达载体构建方法为:根据CsXTH04编码序列设计上游分别含有XbaⅠ、SwaⅠ酶切位点和保护碱基的特异引物,下游分别含有BamHⅠ、AscⅠ酶切位点和保护碱基的特异引物,以cDNA为模板进行PCR扩增得到干扰片段,片段序列如SEQ ID NO:3所示;
将产物回收后分两组,第一组用SwaⅠ和AscⅠ双酶切,第二组用BamHⅠ和XbaⅠ双酶切,酶切回收的两组片段同时连接到pUCr干扰载体的相应部位上,得到中间载体pUCr‑CsXTH04‑RNAi进行测序验证,然后将测序正确的产物和pLGNe超量表达载体用KpnⅠ和SalⅠ分别双酶切,将含有干扰片段的酶切产物连接到pLGNe表达载体上,构建出最终的干扰表达载体pLGNe‑CsXTH04‑RNAi。
5.根据权利要求4所述的一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于,pLGNe载体带有CaMV 35S启动子和GUS编码基因,CaMV 35S启动子为花菜花叶病毒启动子,GUS用作转基因植株检测,分别具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于,步骤(2)中,干扰表达载体转化柑橘的方法为:干扰表达载体通过电击法转化农杆菌,再用农杆菌介导转化柑橘外植体,遗传转化后的外植体细胞再经离体培养、染色鉴定、嫁接后得到转基因植株。
7.根据权利要求1所述的一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于,步骤(2)得到转基因植株后,对转基因植株进行抗性评价,判定CsXTH04基因沉默与柑橘溃疡病的相关性。
8.根据权利要求7所述的一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于,对转基因植株进行抗性评价前,通过PCR验证转基因植株,采用的引物为ID‑CsXTH04‑F和ID‑CsXTH04‑R,分别具有如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的一种利用CsXTH04基因沉默以提高柑橘对溃疡病抗性的方法,其特征在于,PCR验证后,用qRT‑PCR再次验证转基因植株,采用的引物为RT‑CsXTH04‑F和RT‑CsXTH04‑R,分别具有如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列;qRT‑PCR内参为柑橘Actin基因,采用引物为RT‑CsActin‑F和RT‑CsActin‑R,分别具有如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示核苷酸序列。