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专利号: 2018113362297
申请人: 湖南农业大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转iaaM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)黄花蒿腺毛细胞特异表达基因的载体重组构建:

将黄花蒿腺毛特异启动子AaGTpro和iaaM基因构建到Ti质粒的T‑DNA区,以HPT基因为选择标记基因,以pWM101作为出发载体进行改造和载体构建;得到重组Ti质粒pWM101‑AaGTpro::iaaM,所述黄花蒿腺毛特异启动子AaGTpro的序列如SEQ ID NO.1所示,所述重组Ti质粒pWM101‑AaGTpro::iaaM的序列如SEQ ID NO.8所示;

(2)工程化根癌农杆菌的制备:

构建的重组Ti质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404,经过抗生素筛选和分子检测验证工程农杆菌,培养工程农杆菌至对数生长后期;

(3)黄花蒿悬浮细胞系的建立:

将深绿色或淡黄色生长快、结构疏松颗粒状的黄花蒿愈伤组织置于MS液体培养基中,将愈伤轻轻夹碎,摇床150r/min,光照周期为16h/8h光暗交替,温度为25±2℃振荡培养;培养15—20d为悬浮细胞的快速增长且细胞活性较高期,选取该时期的直径在5mm以内的小细胞团及含有单细胞的黄花蒿悬浮细胞系悬浮液,备用;

(4)黄花蒿悬浮细胞的共培浸染转化:

将步骤(3)所得的黄花蒿悬浮细胞系悬浮液与步骤(2)中生长至对数生长后期的工程农杆菌共培2.5—3.5d,然后转入筛选培养基上培养;

(5)转化细胞的筛选和获得抗性愈伤组织:

经步骤(4)共培2.5—3.5d后的黄花蒿悬浮细胞经MS液体培养基冲洗后,置于含200mg/L羧苄青霉素和30mg/LHPT抗性的诱导愈伤及丛生芽分化的培养基上,培养至愈伤上有丛生芽的分化,获得抗性丛生芽并继代增殖;

(6)诱导根分化和获得转基因植株:

当抗性丛生芽生长至3—5cm大小时,将抗性丛生芽转移到生根培养基诱导根分化,分化后幼苗经过炼苗后移栽至营养基质中,获得转基因植株;

(7)转基因植株的分子检测和腺毛细胞发育观察:

提取转基因植株叶片的DNA,用PCR法进行目的基因的分子检测验证,通过体视荧光显微镜观察转基因植株叶片腺毛细胞的密度、大小及荧光强度,通过与对照比较,判断腺毛的发育情况,对腺毛发育具有显著促进的植株进行青蒿素含量测定;

(8)建立转基因黄花蒿品系:

筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株,通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。

2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)是用HindIII和BamH1双酶切pWM101载体,将AaGTpro替换pWM101中的35Spro,完成PWM101‑AaGTpro重组载体构建,再用BamH1和PSt1酶切重组载体PWM101‑AaGTpro,将iaaM基因插入,构建得到腺毛特异表达的重组Ti质粒pWM101‑AaGTpro::iaaM。

3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)是从GenBank中的Nucleotide数据库中获得黄花蒿腺毛特异启动子AaDB2序列信息,设计克隆和同源重组引物,以黄花蒿基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术,获得黄花蒿腺毛特异启动子AaGTpro序列。

4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,构建腺毛特异表达的重组Ti质粒pWM101‑AaGTpro::iaaM所用引物如下:上游引物AaGTpro UP1:CCCAAGCTTTGAAGGATGACCAAAAGCATAA;

下游引物AaGTpro DN1:AGTCATAGGAGCTAACACCACCCT;

上游引物AaGTpro UP2:CCCAAGCTTTGAAGGATGACCAAAAGCATAA;

下游引物AaGTpro DN2:CGGGATCCTATTGAATTTGATGTTGATCAGG;

iaaM UP:GCGGATCCATGTCAGCCTCATCTCTTCT;

iaaM DN:AACTGCAGTTAATTTCTATTGCGGTAGTTATATC。