1.一种抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA,命名为gSmiR30,其序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA,其特征在于,所述gSmiR30通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序,然后选取碱基序列中的“CAGCATTAGAAGCTTTGGCAT”位点作为靶点设计得到。
3.一种抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA,命名为gSmiR70,其序列如SEQ ID NO:3所示;所述gSmiR70通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序,然后选取碱基序列中的“TCTGGATTTAGAGCAAGGAAA”位点作为靶点设计得到。
4.一种抑制鸡Sirt1基因表达的microRNA,命名为gSmiR91,其序列如SEQ ID NO:4所示;所述gSmiR91通过克隆鸡Sirt1基因的3′UTR序,然后选取碱基序列中的“CCATAAGGATGTGGTGTTTAT”位点作为靶点设计得到。
5.一种权利要求1-4中任一所述microRNA过表逆转录病毒载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:利用pLNHX质粒的基础序列和fpcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR质粒上的microRNA表达框架序列构建pLNCX-pmiRG质粒,设计引物,采用PCR扩增法分别在pLNCX-pmirG的microRNA表达框添加插入表达gSmiR30/70/91前体DNA序列,获得重组过表的microRNA的质粒:pLNCX-gSmiR30/70/91。
6.根据权利要求5所述的构建方法,其特征在于,所述pLNCX-gSmiR30设计引物为gga-miR-SIRT1-30-F/R,序列如SEQ ID NO:5-6所示;所述pLNCX-gSmiR70设计引物gga-miR-SIRT1-70-F/R,序列如SEQ ID NO:7-8所示;所述pLNCX-gSmiR91设计引物gga-miR-SIRT1-
91-F/R,序列如SEQ ID NO:9-10所示。
7.权利要求5或6构建所得microRNA过表逆转录病毒载体。
8.权利要求7所述microRNA过表逆转录病毒载体在制备治疗鸡Sirt1基因表达异常相关疾病药物中的应用。
9.一种低表达Sirt1基因的LMH细胞系,其特征在于,利用过表达权利要求1-4中任一所述microRNA构建,包括以下步骤:挑选权利要求1所述的microRNA进行病毒包装后,感染LMH细胞系;然后利用G418抗性加压筛选和绿色荧光蛋白检测结合的方法筛选获得Sirt1基因低表达的LMH亚克隆细胞系。
10.根据权利要求9所述的低表达Sirt1基因的LMH细胞系,其特征在于,所述G418加压筛选的浓度为1μg/mL,筛选10天后,转接细胞后继续加压筛选,重复3-5次,最终以获得绿色荧光蛋白表达率在98%以上的细胞为重组细胞。