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专利号: 2018110154413
申请人: 江南大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-03-02
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体,其特征在于:所述重组表达载体中外源蛋白基因的启动子为cspB启动子、信号肽为cspB信号肽,所述cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,cspB信号肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.如权利要求1所述的一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体,其特征在于:所述重组表达载体的外源蛋白基因下游添加有组氨酸标签。

3.如权利要求2所述的一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体,其特征在于:所述外源蛋白基因为木聚糖酶基因,所述重组表达载体的载体骨架为pxmj19质粒。

4.如权利要求3所述的一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体,其特征在于:所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

5.外源蛋白表达系统,其包括谷氨酸棒杆菌,所述谷氨酸棒杆菌转入有如权利要求1 4~中任一所述的重组表达载体。

6.如权利要求1 4中任一所述的载体在谷氨酸棒杆菌中分泌表达木聚糖酶的应用。

~

7.木聚糖酶的制备方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:(1)获取木聚糖酶基因,所述的木聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;

(2)在所述的木聚糖酶基因下游添加组氨酸标签,获得改造后的木聚糖酶基因;

(3)将改造后的木聚糖酶基因和cspB启动子和信号肽连接到载体pxmj19上,获得重组表达载体pxmj19‑cspB‑cspB‑xynA,所述载体pxmj19的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,所述cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,cspB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示;

(4)将所述重组表达载体pxmj19‑cspB‑cspB‑xynA转入谷氨酸棒杆菌,获得重组菌;

(5)培养所述重组菌,分泌表达木聚糖酶;

(6)木聚糖酶的纯化,包括:

a、将重组菌的培养物进行离心,获得含有木聚糖酶的上清;

b、将所述含有木聚糖酶的上清进行亲和层析,介质为镍柱,获得含有木聚糖酶的洗脱液;

c、将所述含有木聚糖酶的洗脱液进行脱盐,获得纯化的木聚糖酶溶液。

8.根据权利要求7中所述的木聚糖酶的制备方法,其特征在于:所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

9.根据权利要求7中所述的木聚糖酶的制备方法,其特征在于:步骤(6)中,亲和层析中用的平衡、上样的缓冲液A为:300 mMNaCl,20 mMTris,pH 8.0的缓冲液,用于洗脱的缓冲液B为:300 mMNaCl,20 mMTris,250 mM咪唑,pH 8.0的缓冲液。

10.根据权利要求7所述的木聚糖酶的制备方法,其特征在于,步骤(6)中,所述脱盐的介质为脱盐柱。