1.敲除或敲低家蚕溶茧酶基因阻断蚕蛾出茧的方法,其特征在于:构建基于piggyBac的Cas9表达载体,并制备Cas9转基因家蚕;然后构建靶标溶茧酶基因的sgRNA表达载体,并制备sgRNA转基因家蚕;将sgRNA转基因家蚕和Cas9转基因家蚕进行杂交、荧光筛选不可再继续产生编辑的个体进行PCR分型检测,筛选到杂合体,杂合体自交,经过对突变序列的分型检测及克隆测序鉴定出后代中的纯合突变个体,扩大饲养,继而获得阻断家蚕蛾出茧的品系;
所述基于piggyBac的Cas9表达载体由以下方法构建:以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述序列为引物扩增IE1启动子,然后将扩增产物用Ngo MIV和Kpn I酶切后连入经同样酶切的pCS7‑Cas9载体,获得pCS7‑{IE1‑Cas9} 中间载体,使用酶切位点Ngo MIV和Not I将Cas9的完整表达盒切下,经平末端连接于由Asc I线性化的 piggyBac‑{3xp3‑EGFP} 载体中,获得基于piggyBac的Cas9表达载体,命名为piggyBac‑{3xp3‑EGFP,IE1‑Cas9};所述sgRNA表达载体的序列由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列退火后形成双链,然后克隆至Bbs I线性化的 PUC57‑{BmU6‑gRNA} 载体中,获得PUC57‑{BmU6‑gRNAC2}中间载体,然后将PUC57‑{BmU6‑gRNAC2}中间载体经Age I和Sac II切下后经平末端连接于 piggyBac‑{3xp3‑DsRED}经Bgl II线性化的空载中,获得sgRNA表达载体,命名为 piggyBac‑{3xp3‑ DsRED,BmU6‑gRNAC2}表达载体。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述筛选不可再继续产生编辑的个体的方法为筛选眼部带有红色和绿色荧光的双元转基因个体,将F1代中双元转基因个体自交或双元转基因个体与非转基因个体进行杂交获得其后代F2,选取F2代中仅携带红色荧光或仅携带绿色荧光的个体或不携带荧光蛋白标记的个体。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述PCR分型检测为将筛选的不可再继续产生编辑的个体饲养至蛾羽化,提取蚕蛾的翅基因组,用SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列为引物进行测序,测序峰图于PAM基序附近出现套峰,即为杂合体;杂合体自交,经过对溶茧酶基因序列的克隆鉴定,获得茧酶基因敲除的纯合突变个体,继而扩大饲养,获得阻断蚕蛾出茧的家蚕品系。
4.权利要求1‑3任一项所述的方法在制备阻断家蚕蛾出茧的家蚕品种中的应用,其特征在于:所述家蚕溶茧酶基因如SEQ ID NO.3所示。