1.一种辣椒抗菌肽的提取纯化方法,其特征在于,包括以下提取步骤和纯化步骤,所述提取步骤包括以下步骤:A.将辣椒籽粉碎过筛,得到辣椒籽粉;
B.按一定的料液比将步骤1的辣椒籽粉添加至缓冲液中,低温条件下浸提;
C.将步骤2得到的浸提液离心,得到上清液;
D.在步骤3得到的上清液中加入硫酸铵,均匀搅拌使其充分溶解后低温条件下静置;
E.将步骤4的硫酸铵溶液离心,收集沉淀,即为提取的抗菌肽,所述纯化步骤包括以下步骤:
F.抗菌肽的脱盐及粗分离:将上述提取步骤得到的抗菌肽进行复溶液透析;
G.对步骤1透析后的提取液进行凝胶层析,收集出现波峰时的所对应的样品;
H.对得到的各成分进行活性测定,得到目标产品。
2.根据权利要求1所述的提取纯化方法,其特征在于,
步骤A中所述辣椒籽选自天鹰小椒、石竹红、新化、子弹头、印度椒和贵州灯笼椒中的一种,优选地,所述辣椒籽为贵州灯笼椒;
步骤A中所述料液比为1:1~1:10,优选地,所述料液比为1:3、1:5、1:7或1:9,更优选地,所述料液比为1:5;
步骤A中所述缓冲液为无菌水、PBS、EDTA、Tris-HCl和75%乙醇中的一种,优选地,所述缓冲液为EDTA;
步骤B中所述低温条件为0~10℃,优选地,所述低温条件为2~5℃,更优选地,所述低温条件为4℃;
步骤B所述浸提的时间为4~24h,优选地,所述浸提的时间为4、8、12、16、20或24h,更优选地,所述浸提的时间为16h;
步骤C中所述离心的转速为3000~15000rpm,优选地,所述离心的转速为5000~
12000rpm,更优选地,所述离心的转速为8000rpm;
步骤C中所述离心的时间为5~30min,优选地,所述离心的时间为10~20min,更优选地,所述离心的时间为15min;
步骤D中所述加入硫酸铵为加入固体硫酸铵,加入硫酸铵使溶液中的浓度达到30~
100%,优选地,加入硫酸铵使溶液中硫酸铵的浓度达到40%、50%、60%、70%、80%或
90%,更优选地,加入硫酸铵使溶液中硫酸铵的浓度达到80%以上,最优选地,加入硫酸铵使溶液中硫酸铵的浓度达到80%;
步骤D中所述低温条件为0~10℃,优选地,所述低温条件为2~5℃,更优选地,所述低温条件为4℃;
步骤D中所述静置的时间为为0.5~6h,优选地,所述静置的时间为1~5h,更优选地,所述浸提的时间为4h;
步骤E中所述离心的转速为5000~15000rpm,优选地,所述离心的转速为8000~
12000rpm,更优选地,所述离心的转速为10000rpm;
步骤E中所述离心的时间为5~30min,优选地,所述离心的时间为10~20min,更优选地,所述离心的时间为15min;
步骤F中所述复溶液为:0.02mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)。
步骤F中所述透析所用的透析袋截留分子量为0.5-5kDa,优选地,所述透析所用的透析袋截留分子量为1kDa;
步骤F中所述透析是在低温条件下进行的,所述低温条件为0~10℃,优选地,所述低温条件为2~5℃,更优选地,所述低温条件为4℃;
步骤F中所述透析时间为4~24h,优选地,所述透析时间为8~16h,更优选地,所述透析的时间为12h;
步骤F中所述透析过程中不断换液,优选地,每隔2个小时换液一次,优选地,透析期间换液3~4次,更优选地,透析期间换液4次;
步骤G中所述凝胶层析采用填料葡聚糖凝胶G-50进行;
步骤G中所述凝胶层析包括以下步骤:
(a)装柱:室温下,用灭菌的去离子水将葡聚糖凝胶充分溶胀,中途搅拌,以保证凝胶的完全溶胀,然后将溶胀好的凝胶真空抽滤处理除去凝胶液中的空气,然后根据装柱要求一次性置入柱内,避免柱内出现气泡和断层现象,(b)凝胶柱的平衡:将装好的柱子按说明书要求组装,然后用去离子水对柱子进行平衡,直到检测洗脱液pH值恒定时为止,(c)上样:将步骤1的提取液按5mL的加样体积进行上样,优选地,在上样之前对所述提取液进行过滤膜(0.22μm)处理,(d)洗脱:使用灭菌的去离子水洗脱样品,优选地,恒流泵设定恒速为10~50rpm,更优选地,设定恒速为20rpm,优选地,流速设定为0.5~1.5mL/min,更优选地,流速设定为
0.8mL/min,优选地,洗脱时间为100-500min,更优选,洗脱时间为250min,(e)样品收集:紫外检测波长为280nm,分别收集出现波峰时所对应的样品;
将步骤G收集到的样品进行冷冻干燥处理,并取适量冻干后的不同样品分别用PBS缓冲液(pH=7.4)配成适宜浓度后,进行步骤H的活性测定,从而确定最终样品。
3.根据权利要求1所述的提取纯化方法,其特征在于,在步骤A和B之前,进一步包括无水乙醚浸泡的步骤,优选地,无水乙醚浸泡时间为2~24h,优选地,浸泡时间为6~16h,更优选地,浸泡时间为8h。
4.根据权利要求1所述的提取纯化方法,其特征在于,在步骤C之前进一步包括将步骤B的浸提液过滤的步骤,优选地,所述过滤为利用纱布过滤,更优选地,所述过滤为利用2~8层纱布过滤,更优选地,所述过滤为利用3-6层纱布过滤,例如,利用3、4、5或6层纱布过滤,最优选地,所述过滤为利用4层纱布过滤。
5.根据权利要求1所述的提取纯化步骤,其特征在于,所述步骤D和步骤E反复多次进行,第一次重复中步骤D中加入硫酸铵使得溶液中硫酸铵的浓度低于70%,步骤E中进一步包括收集上清液的步骤,利用收集到的上清液进入下一重复,以后每一重复使得溶液中硫酸铵浓度逐渐增加,收集每一重复的沉淀冻干保存。
6.根据权利要求5所述的提取纯化方法,其特征在于,包括2个重复,第一个重复中使得溶液中硫酸铵的浓度达到40~60%,第二个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到80~100%,收集每一重复的沉淀冻干保存,优选地,第一个重复中使得溶液中硫酸铵的浓度达到40%,第二个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到80%。
7.根据权利要求5所述的提取纯化方法,其特征在于,包括3个重复,第一个重复中使得溶液中硫酸铵的浓度达到30~50%,第二个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到51~70%,第三个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到80~100%。
8.根据权利要求5所述的提取纯化方法,其特征在于,包括3个重复,第一个重复中使得溶液中硫酸铵的浓度达到40~70%,第二个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到71~90%,第三个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到91~100%,收集每一重复的沉淀冻干保存,优选地,第一个重复中使得溶液中硫酸铵的浓度达到40%,第二个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到80%,第三个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到100%。
9.根据权利要求5所述的提取纯化方法,其特征在于,包括4个重复,第一个重复中使得溶液中硫酸铵的浓度达到30~50%,第二个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到51~70%,第三个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到80~90%,第四个重复使得溶液中硫酸铵的浓度达到91~100%,收集每一重复的沉淀冻干保存。
10.根据权利要求1所述的提取纯化方法,其特征在于,在步骤F与G之间,进一步包括将提取液进行超滤的步骤,优选地,将透析后的提取液加入10kDa超滤管,5000rpm/min离心1h,分别收集超滤管上部的截留液和管底液,并比较两个组分在相同蛋白浓度下的抑菌活性,选择效果好的组分继续分离纯化。