1.一种重组质粒,其特征在于,所述重组质粒由大肠-枯草穿梭质粒pPsacB-NMK与含有信号肽SP和菊粉内切酶的CDS序列inuQ的片段相连得到,所述信号肽SP为SPsacB、SPsacC、SPbpr、SPamye或SPnprb。
2.权利要求1所述的重组质粒的构建方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
1)选定霉味假单胞菌中的菊粉内切酶的CDS序列,设计并合成引物,通过PCR扩增调取菊粉内切酶的基因inuQ;所述引物序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示;
2)将菊粉内切酶的CDS序列inuQ与信号肽进行重叠PCR,得到含有信号肽SP的片段;所述信号肽SP为SPsacB、SPsacC、SPbpr、SPamye或SPnprb;
3)表达载体pPsacB-NMK-SPinuQ的构建:以大肠-枯草穿梭质粒pPsacB-NMK为质粒骨架,利用限制性内切酶PstI和HindIII双酶切质粒pPsacB-NMK,获得双酶切质粒;
4)采用一步克隆的方法将步骤2)获得的含有信号肽SP的片段与步骤3)获得的双酶切质粒连接,形成重组质粒pPsacB-NMK-SP-inuQ。
3.一种可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,该重组枯草芽孢杆菌由权利要求1所述的重组质粒通过转化枯草芽孢杆菌WB800-R获得;所述枯草芽孢杆菌WB800-R是在基因工程菌WB800的基础上敲除果聚糖酶SacC得到的缺陷型菌株。
4.一种制备权利要求3所述的可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌的方法,其特征在于,该方法包括:将所述重组质粒转化进所述枯草芽孢杆菌WB800-R中,通过所述重组质粒在所述枯草芽孢杆菌WB800-R中的卡纳抗性标记筛选阳性转化子,即得到所述可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,通过化学转化法将所述重组质粒转化进枯草芽孢杆菌WB800-R中。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述通过重组质粒在枯草芽孢杆菌WB800-R中的卡纳抗性标记筛选阳性转化子是使用浓度为25μg/mL 50μg/mL的卡纳抗生素进行筛~选。
7.权利要求3所述的可胞外分泌菊粉内切酶的重组枯草芽孢杆菌在制备菊粉内切酶和制备低聚果糖中的应用。
8.一种菊粉内切酶的制备方法,其特征在于,该制备方法包括以下步骤:
1)将权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌划线到含有25 50μg/mL卡纳抗生素的固体LB~平板上,37℃培养箱12 h,挑单菌落接LB培养基,37℃,200 rpm摇菌12 h进行活化,将活化后的重组枯草芽孢杆菌以2%接种量接种到含有产酶培养基的摇瓶中,加入蔗糖,32℃,200 rpm,摇菌,发酵48-72 h得到发酵液;
2)使用硫酸铵沉淀方法对步骤1)制得的发酵液进行粗提酶液,然后用透析袋4℃过夜透析,得到浓缩后的酶液,最后利用超滤管4℃,9000 rpm离心10min,得到菊粉内切酶酶液。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述蔗糖的浓度为5.0 20.0 g/L,所~述产酶培养基包含5.0 20.0 g/L蔗糖、20.0~22.0 g/L酵母粉、15.0~16.5 g/L NaCl、0.5~~0.8 g/L MgSO4·7H2O和2.0~2.8 g/L KH2PO4。
10.一种低聚果糖的制备方法,其特征在于,该制备方法包括以下步骤:将权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌划线到含有25 50μg/mL卡纳抗生素的固体LB平板上,37℃培养箱12 ~h,挑单菌落接LB培养基,37℃,200 rpm摇菌12 h进行活化,将活化后的重组枯草芽孢杆菌以2%接种量接种到含有发酵培养基的摇瓶中,以菊粉为底物,加入5.0-20.0 g/L蔗糖,在32℃,200rpm条件下摇瓶培养48h-60h得到发酵液,将发酵液在12000rpm下离心10min,除去菌体,取上清得到低聚果糖;所述发酵培养基包含20.0~22.0g/L酵母粉,15.0~16.5 g/L NaCl,0.5~0.8 g/L MgSO4·7H2O,2.0~2.8 g/L KH2PO4。