1.一种构建同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1、构建自主装模块质粒pDGI‑7S6‑P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis，包括如下步骤：

（1）以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P43、分泌信号肽PhoD基因片段；

（2）以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段；

（3）以pUC57‑spyCatcher质粒为模板PCR扩增spyCatcher基因片段；

（4）利用重叠PCR连接步骤（1）中的启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段、步骤（2）中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段和步骤（3）中的spyCather基因片段，制得P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis融合基因片段；

（5）将可消除抗性的枯草芽孢杆菌amyE基因位点整合载体pDGI‑7S6质粒用限制性内切酶BamHI/HindIII进行双酶切，然后与步骤（4）制得的融合基因片段利用无缝克隆技术进行连接，得到可以消除抗性的无痕整合载体，即为自主装模块质粒pDGI‑7S6‑P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis；

所述整合载体pDGI‑7S6是将Cre/lox定点重组系统的lox71‑spc‑lox66基因片段替换整合载体pDG1730的第961和第1714碱基之间的壮观霉素抗性基因spc构建而成，并命名pDGI‑7S6；

步骤2、构建自组装模块质粒pAX01‑7S6‑P43‑PhoD‑spyTag‑linker‑spyTag‑MTHase‑spyTag‑6xHis，包括如下步骤：a、以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段；

b、以pUC57‑spyTag‑linker‑spyTag质粒为模板扩增spyTag‑linker‑spyTag基因片段；

c、以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase+spyTag基因片段；

d、利用重叠PCR连接步骤a中的启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段、步骤b中的spyTag‑linker‑spyTag基因片段、步骤c中的麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase+spyTag基因片段制得P43‑PhoD‑spyTag‑linker‑spyTag‑MTHase‑spyTag‑6xHis融合片段；

e、将可消除抗性的枯草芽孢杆菌lacA基因位点整合载体pAX01‑7S6质粒用限制性内切酶SacII/BamHI进行双酶切，然后与步骤d制得的融合基因片段利用无缝克隆技术进行连接，得到无痕整合载体，即为自组装模块质粒pAX01‑7S6‑P43‑PhoD‑spyTag‑linker‑spyTag‑MTHase‑spyTag‑6xHis；

所述整合载体pAX01‑7S6是将Cre/lox定点重组系统的lox71‑spc‑lox66基因片段插入整合载体pAX01的第2235和第2236碱基之间构建而成，并命名pAX01‑7S6；

步骤3、将步骤1和步骤2构建的自组装模块质粒，分别转化进B.subtilis WB800n菌体中，制得重组B.subtilis WB800n，同时将温敏型抗性消除质粒pTSC质粒转入所述重组B.subtilis WB800n中，经变温培养得到可用于食品生产的无痕整合型重组B.subtilis WB800n。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中启动子P43基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如 SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.4所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中spyCatcher基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）或（3）中PCR扩增体系如下：

10 μmol/L上游引物2.5 μl，10 μmol/L下游引物2.5 μl，基因模板2.5 μl，2×Phanta Max Master Mix 25 μl，加ddH2O到50μl。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的重叠PCR扩增体系如下，总体积为50μl：

启动子P43基因片段4 μl，分泌信号肽PhoD基因片段4 μl，MTSase基因片段4 μl，spyCatcher基因片段4 μl，2×Phanta Max Master Mix 25 μl，加ddH2O至50μl；

重叠PCR的扩增程序如下：

95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，62℃退火15 sec，72℃延伸1min 30sec，10个循环；72℃延伸5 min；

重叠PCR的补充扩增体系如下，总体积为50μl：重叠体系10μl，10 μmol/L上游引物SEQ ID NO.1 2.5 μl，10 μmol/L下游引物SEQ ID NO.8 2.5 μl，2×Phanta Max Master Mix 25 μl，加ddH2O到50μl；

重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，60℃退火15 sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环；72℃延伸5 min。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中将步骤1构建的自组装模块质粒pDGI‑7S6‑P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis转入B.subtilis WB800n后，整合到基因组中的amyE位点，得到整合型重组菌株；将pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中，获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述质粒整合到amyE位点的整合型重组菌株筛选：将转化子涂布于含100μg/mL壮观霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取壮观霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100μg/mL壮观霉素抗性的LB液体培养基，

37℃培养12h，分别以所得菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis的筛选：将转化子涂布于5μg/mL红霉素LB平板进行筛选，将红霉素LB平板长出的转化子接种于无抗性的LB液体培养基中，经IPTG诱导培养48h；取少量诱导培养后的菌液，涂布于无抗性的LB固体培养基中，待长出单菌落，接种到分别含5μg/mL红霉素和100μg/mL壮观霉素的LB固体培养基中，若在无抗性培养基中生长，分别在红霉素和壮观霉素固体培养基中不生长即获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中启动子P43基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.2所示。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.10所示。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b中，spyTag‑Linker‑spyTag基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c中，麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因MTHase+spyTag基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a、b或c中PCR扩增体系如下：

10 μmol/L上游引物2.5 μl，10 μmol/L下游引物2.5 μl，基因模板2.5 μl，2×Phanta Max Master Mix 25 μl，加ddH2O到50μl。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d中的重叠PCR扩增体系如下，总体积为50μl：

启动子P43基因片段4 μl，分泌信号肽PhoD基因片段4 μl，spyTag‑linker‑spyTag基因片段4 μl，MTHase+spyTag基因片段4 μl，2×Phanta Max Master Mix 25 μl，加ddH2O到50μl；

重叠程序如下：

95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，62℃退火15 sec，72℃延伸1min 30sec，10个循环；72℃延伸5 min；

重叠PCR的补充扩增体系如下，总体积为50μl：重叠体系10μl，10 μmol/L上游引物SEQ ID NO.9 2.5 μl，10 μmol/L下游引物SEQ ID NO.14 2.5 μl，2×Phanta Max Master Mix 25 μl，加ddH2O到50μl；

重叠PCR的补充扩增程序如下：

95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，60℃退火15 sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环；72℃延伸5 min。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中步骤2构建的自组装模块质粒pAX01‑7S6‑P43‑PhoD‑spyTag‑linker‑spyTag‑MTHase‑spyTag‑6xHis转入B.subtilis WB800n/P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis后，整合到基因组中的lacA位点，得到整合型重组菌株；将pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中，获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis/P43‑PhoD‑spyTag‑linker‑spyTag‑MTHase‑spyTag‑6xHis。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述质粒整合到lacA位点的整合型重组菌株筛选：将转化子涂布于含100μg/mL壮观霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取壮观霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100μg/mL壮观霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以所得菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株。

19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis/P43‑PhoD‑spyTag‑linker‑spyTag‑MTHase‑spyTag‑6xHis的筛选：将转化子涂布于5μg/mL红霉素培养基中进行筛选，将红霉素LB平板长出的转化子接种于无抗性的LB液体培养基中，经IPTG诱导培养48h；取少量诱导培养后的菌液，涂布于无抗性的LB固体培养基中，待长出单菌落，接种到分别含5μg/mL红霉素和100μg/mL壮观霉素的LB固体培养基中，若在无抗性培养基中生长，分别在红霉素和壮观霉素固体培养基中不生长即获得无痕整合重组菌。

20.权利要求1‑19任意之一所述的方法构建的同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌在发酵生产海藻糖中的应用。