1.一种检测叶酸功能化二氧化硅靶向纳米药物载体的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:a、SiO2-FO包被抗原和免疫原的制备;
b、抗SiO2-FO多克隆抗体的制备;
c、BODIPY-PFNPs的制备;
d、BODIPY-PFNPs与抗SiO2-FO抗体的交联;
e、以SiO2-FO-OVA为包被抗原,以BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体作为一抗,建立直接竞争荧光免疫分析法定量检测SiO2-FO;以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标,荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线,从而定量检测出SiO2-FO的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤c采用沉淀聚合法合成BODIPY-PFNPs,具体包括以下步骤:c-1、将氟化硼二吡咯BODIPY荧光染料与丙烯酰胺AM溶于乙腈中,充分混匀;
c-2、加入交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯EDGMA,超声混匀;
c-3、再加入引发剂偶氮二异丁腈AIBN,磁力搅拌混匀;
c-4、通氮气,然后密封,置于油浴锅中,50~65℃条件下恒温聚合h;
c-5、聚合完成后,离心分离,先用无水甲醇清洗2次,再用乙腈洗至上清液无荧光,冷冻干燥即得包裹BODIPY的新型聚合物纳米粒子(BODIPY-PFNPs),4℃保存。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述步骤c具体包括以下步骤:c-1、将0.05~0.1mmol氟化硼二吡咯BODIPY荧光染料与0.5~1.0mmol丙烯酰胺AM溶于
30~50mL乙腈中,充分混匀;
c-2、加入1.0~1.5mmol交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯EDGMA,超声混匀10~20min;
c-3、再加入3~10mg引发剂偶氮二异丁腈AIBN,磁力搅拌混匀;
c-4、通氮气8~15min,密封,置于油浴锅中,50~65℃条件下恒温聚合24h;
c-5、聚合完成后,离心分离,先用无水甲醇清洗2次,再用乙腈洗至上清液无荧光,冷冻干燥即得包裹BODIPY的新型聚合物纳米粒子(BODIPY-PFNPs),4℃保存。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,其中BODIPY、AM、EDGMA三者之间的物质的量之比1:16:24。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤d采用碳二亚胺法将BODIPY-PFNPs与抗SiO2-FO抗体进行交联,包括以下步骤:d-1、将步骤c制备的BODIPY-PFNPs洗涤后,分散在PBS缓冲液中;
d-2、将EDAC和NHS溶于水中,混合后加入到步骤d-1制备的BODIPY-PFNPs溶液中,搅拌反应;
d-3、将反应液离心分离,洗涤沉淀,然后重新分散在PBS溶液中;
d-4、用PBS将抗SiO2-FO多克隆抗体稀释,取该抗体溶液加入到步骤d-3制备的BODIPY-PFNPs溶液中,搅拌反应;
d-5、反应结束后,离心分离,洗涤沉淀,然后分散于PBS缓冲液中即为BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体,4℃保存。
6.根据权利要求1或5所述的方法,其特征在于,所述步骤d具体包括以下步骤:d-1、将2~10mg BODIPY-PFNPs用PBS洗涤3次,并分散在1~2mL PBS缓冲液中;
d-2、将5~15mg EDAC和0.5~1.5mg NHS溶于1~2mL水中,混合后加入到上所述所得的溶液中,25~30℃搅拌反应10~20min;
d-3、将反应液离心分离,沉淀用PBS洗涤2次,并分散在1~2mL PBS溶液中;
d-4、用PBS将抗SiO2-FO抗体稀释成2mg/mL,取1~2mL该抗体溶液加入到步骤d-3制备的BODIPY-PFNPs溶液中,25~30℃搅拌反应3~5h;
d-5、离心分离,沉淀用PBS洗涤2次,然后分散于1~2mL PBS缓冲液中即为BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体,4℃保存。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤e具体包括以下步骤:e-1、包被:用包被缓冲液将SiO2-FO包被抗原稀释200倍,包被96孔酶标板,每孔100μL,4℃冰箱过夜;
e-2、封闭:甩干,PBST溶液洗涤3次,每次3~5min,洗去多余的SiO2-FO包被抗原,加入
1.5wt%酪蛋白进行封闭,每孔200μL,37℃烘箱温育1~2h;
e-3、加样竞争:甩干,PBST溶液洗涤3次,每次3~5min,洗去多余的封闭液,然后将50μL不同浓度的SiO2-FO标准品溶液和50μL一定浓度的BODIPY-PFNPs标记的抗SiO2-FO抗体溶液分梯度加入各孔中,使之发生竞争反应,37℃烘箱温育3~5h;
e-4、检测:甩干,PBST溶液洗涤3次,每次3~5min,除去游离态的SiO2-FO标准品或抗体结合物,用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为485nm,发射波长为528nm处的荧光强度值;
以SiO2-FO标准品浓度的对数为横坐标,荧光强度值为纵坐标绘制标准曲线,从而定量检测出SiO2-FO的浓度。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤e-4所述标准曲线的线性方程为A=
38918-3593logC,其中A为荧光强度值,C为SiO2-FO浓度,其相关系数R=-0.998,线性范围为10-3-102ng/mL,检出限为0.43pg/mL。