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专利号: 2017107052960
申请人: 南通大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2026-04-30
缴费截止日期: 暂无
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摘要:

权利要求书:

1.一种日本血吸虫蛋白SjP40在制备抑制由TGF-β1诱导的LX-2细胞的活化的制剂中的应用,其特征是:所述日本血吸虫蛋白SjP40是序列号:FJ531701.1的核苷酸编码的SjP40蛋白。

2.根据权利要求1所述的日本血吸虫蛋白SjP40在制备抑制由TGF-β1诱导的LX-2细胞的活化的制剂中的应用,其特征是:所述日本血吸虫SjP40蛋白,其表达纯化方法包括下列步骤:(1)重组表达质粒的构建与鉴定

Trizol 提取日本血吸虫虫卵总RNA:采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, 以Oligo ( dT ) 18 为模板将mRNA 逆转录为cDNA ;根据 Genbank 数据库中日本血吸虫SjP40序列, 利用primer 5.0 软件设计SjP40 基因上游引物和下游引物, SjP40 上游引物:5’-GAAATTCGGTGTCGATAAAGC-3’;SjP40下游引物:5’- CACAAGTGAATATCATCATTACCAT-3’;以 cDNA为模板,PCR 扩增SjP40 基因;PCR 反应条件:94℃ 预变性3min;94℃ 变性30s,60℃ 退火30s,72℃ 延伸 2min,扩增 30个循环;72℃ 继续延伸10min;PCR 产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离, 胶回收试剂盒纯化;将PCR产物连入pMD19-T载体,连接产物转化入感受态细菌E.coli. DH5α,挑取阳性克隆,提取质粒,进行测序,测序比对正确的质粒命名为pMD19-T- SjP40;

(2)设计引物,在引物两端加入限制性酶切位点及保护碱基,引入酶切位点以下划线表示;上游引物:5’- GGAATTCCATATGATGTCGGGTACACATCAAAACCATG-3’(NdeⅠ);下游引物:5’-CCCAAGCTTTAATGAGCGATTTCGTGTTGCTTCA-3’(HindⅢ);以 pMD19-T- SjP40为模板进行PCR,PCR 反应条件: 94℃ 预变性3min;94℃ 变性20s,60 ℃ 退火30s,72℃ 延伸 1min,扩增 

35个循环;72℃ 继续延伸5min;PCR 产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳分离, 胶回收试剂盒纯化;胶回收产物与pET-28a(+)质粒分别用NdeⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切, 胶回收试剂盒纯化后, 用T4 DNA 连接酶连接, 构建pET-28a-SjP40 重组质粒;重组质粒经PCR 和双酶切验证后, 进行测序;

(3)重组蛋白的表达及纯化

将重组表达质粒转化至感受态菌E.coli.BL21(DE3)中,挑取阳性克隆,37℃ 培养过夜;将菌液以1:100接种于含卡那霉素的液体LB培养基,37℃,200rpm培养至OD值为0.4 0.6~时,分别取出1ml 未诱导的菌液作为对照,其余液体中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG) 诱导蛋白的表达,收集菌体,通过SDS-PAGE电泳分析,鉴定重组蛋白的表达;经过对温度、时间、IPTG浓度条件进行优化,最终确定诱导表达条件为: 0.1mM的 IPTG,30℃诱导

8h,大量诱导表达后,收集上清,经Ni-NTA柱纯化后,透析膜透析,最终使蛋白溶于PBS中,并进行去内毒素处理。