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专利号: 2017102025473
申请人: 陕西师范大学
专利类型:发明专利
专利状态:已下证
更新日期:2025-10-14
缴费截止日期: 暂无
联系人

摘要:

权利要求书:

1.一种抗凋亡细胞系,其特征在于,在真核细胞中缺失了Caspase3、Caspase6、Caspase7、AIF1四个基因;

所述的真核细胞是HEK293细胞,所述抗凋亡细胞系的建立方法由下述步骤组成:(1)筛选靶向Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1基因外显子区的sgRNA从NCBI查找Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1四个基因的基因组序列,分别在每个基因的外显子区选择四个sgRNA结合位点并设计相应的sgRNA引物,将sgRNA引物退火后连接到sgRNA表达载体,与Cas9表达载体共转染到HEK293细胞后,收集基因组DNA通过T7E1检测每个sgRNA的切割效率,从靶向每个基因的sgRNA中挑选一个效率最高的待用;

(2)构建携带Cas9、sgRNA、puromycin表达元件的真核表达载体将筛选获得的靶向Caspase3基因的sgRNA表达元件、Cas9表达元件、puromycin表达元件依次插入到真核表达载体,获得pCas9-Casp3 sgRNA-puromycin,将靶向Caspase6、Caspase7和AIF1的sgRNA表达元件串联,与Cas9表达元件、puromycin表达元件依次插入到真核表达载体,获得pCas9-CCA sgRNAs-puromycin;

(3)建立Caspase3敲除的真核细胞系

将pCas9-Casp3 sgRNA-puromycin转染目标细胞,转染24小时后用puromycin筛选24-

48小时,进行克隆化,获得Caspase3敲除的真核细胞系;

(4)建立Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1敲除的真核细胞系将pCas9-CCA sgRNAs-puromycin转染Caspase3敲除的细胞系,转染24小时后用puromycin筛选24-48小时,进行克隆化,获得Caspase3、Caspase6、Caspase7和AIF1敲除的真核细胞系。

2.权利要求1所述的抗凋亡细胞系在蛋白表达中的应用。

3.权利要求1所述的抗凋亡细胞系在腺病毒包装中的应用。

4.权利要求1所述的抗凋亡细胞系在腺相关病毒包装中的应用。

5.权利要求1所述的抗凋亡细胞系在慢病毒包装中的应用。